中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2005,25(9):59～64透明质酸酶和油酸增强外源基因在机体内的表达*任智慧1朱开春1金华利2江睿2张富春1王宾1,2**（1新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室乌鲁木齐830046)(2中国农业大学生物学院农业生物技术国家重点实验室北京100094)摘要以研究外源基因有效发送至靶细胞并高效表达为目的，为了获得能提高外源基因在机体内表达量的增强剂,以pCMVβgal作为报告基因，分别辅以油酸和透明质酸酶两种不同的生化试剂，注射小鼠后肢腿部肌肉。通过检测在两种不同的生化试剂作用下，pCMVβgal在机体内表达量的差异，以期获得能提高外源基因表达量的增强剂。结果证明油酸和透明质酸酶均能有效提高pCMVβgal在小鼠体内的表达量，其中透明质酸酶引起的增强效果更为显著，是较好的基因表达增强剂。关键词pCMVβgal体内表达油酸透明质酸酶表达增强剂收稿日期：20050304修回日期：20050411*国家“863”计划(2003AA241110和2004AA213102)，国家自然科学基金资助项目(30271220)**通讯作者，电子信箱：bwang3@cau.edu.cn外源基因能否有效发送至哺乳动物细胞中并高效表达，对于基因治疗、基因调节和基因疫苗的研究、发展和应用都是至关重要的。然而,裸DNA通常很难有效地进入细胞，据研究每一千个质粒分子中仅有一个可以进入细胞中并表达［1］，对于一些大分子量的外源基因尤其需要克服细胞膜这一障碍［2］；其次，质粒DNA容易被存在于细胞质中的核酸酶所降解，致使其不能以完整的形式存在于细胞质中［3］；最后，质粒DNA能否有效进入细胞核中也是基因发送过程中的关键所在［2］。因此关于基因发送的各种方法也得以广泛研究和应用。为了增加外源基因在机体内的表达，研究人员从多个角度对目的基因进行了改造，比如选择含有组织特异性启动子的表达载体，密码子优化修饰目的基因等［4］,均取得了较好的效果。如果同时改进基因发送系统,使进入细胞的质粒DNA分子的绝对数量增加,一定会取得更好的预期效果.已有研究证明,一些化学和物理的方法均能成功地促使外源基因进入细胞，例如显微注射和电穿孔方法甚至能将大分子物质直接导入细胞［6］；基因枪的使用可使极少量的外源基因在机体内就得以表达［6］；脂质体广泛适用于不同大小和生化特性的物质；布比卡因［7］、二乙氨乙基葡聚糖、磷酸钙和氯化钙均能有效促使外源基因进入目的细胞［5］等等，相比较而言，化学试剂具有性质稳定，使用方便，成本低廉，可操作性强的优点。本研究也是以提高外源基因在机体内的表达为目的，选用油酸和透明质酸酶这两种生化试剂分别与外源基因混合后注射小鼠，检测报告基因的表达量，验证这两种生化试剂在增强外源基因表达中的作用。1材料与方法1．1材料质粒pCMVβgal及E.coliTOP10菌株为本实验室保存。分子生物学实验试剂：限制性内切酶、DNAmarker、Xgal均购自TaKaRa公司，油酸，透明质酸酶购自Sigma公司。固定液:4%多聚甲醛,1%戊二醛，0.01%NP40,0.01%脱氧胆酸钠。组织染液:100mmol/LNa3PO4(pH7.3),1.3mmol/LMgCl2,3mmol/LK3Fe(CN)6,3mmol/LK4Fe(CN)6,1mg/mlXgal。实验动物：昆明白雌性小鼠（6周龄）购自中国医学科学院实验动物研究所。1．2方法1．2．1质粒的提取和鉴定真核表达重组质粒pCMVβgal转化E.coliTOP10，培养发酵。收集菌体后采用碱裂解法提取质粒，用PEG8000纯化。EcoRI和HindIII双酶切鉴定。1．2．2质粒DNA的体外转染按Invitrogen公司LipofectamineTM2000转染试剂盒说明将质粒pCMVβgal转染BHK细胞；转染后的第三天，用4％的多聚甲醛固定5min，用PBS洗去固定液；加Xgal染色液，室温过夜。在光镜下观察结果，并照相记录。1.2.3质粒DNA的体内表达分别用不同剂量的pCMVβgal质粒0μg、50μg和100μg分点注射6周龄昆明白雌性小鼠后肢腿部肌肉。注射7d后处死小鼠，取后肢，去皮，迅速置于低温固定液中，4℃固定2h。用PBS洗去固定液，将样品置于含Xgal的染色液中，室温过夜。用PBS洗去染液。照相记录，比较质粒DNA的表达量。1．2．4基因表达增强剂效果的检测6周龄昆明白雌性小鼠按不同增强剂分组，每组6只。注射部位为小鼠后肢腿部肌肉，各组小鼠左腿均注射质粒pCMVβgal与增强剂的混合物，每组中3只小鼠右腿只注射质粒pCMVβgal作为阳性对照，