第六章基因工程的基本技术核酸提取技术凝胶电泳技术PCR技术核酸杂交技术DNA测序技术第一节、第二节前章节已介绍第三节PCR技术第三节PCR技术中文名称:聚合酶链式反应PCR操作流程2、PCR反应过程:3、PCR反应体系:1)、引物(寡聚核苷酸)2)、模板DNA:基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段;质量要求:不高3)、Taq酶(热稳定性):常规酶高保真酶:ExTaqLaTaq酶4)、反应缓冲液成分:BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用Tris、cl提供缓冲作用大家有疑问的，可以询问和交流4、影响PCR产量、质量得因素:(3)模板:主要考虑纯度及使用量对纯度要求不高,但含有酚、氯仿等杂质则难以成功。使用量从几个ng到100ng;(4)引物浓度:0、1-0、5µmol/L之间,过多则非特异扩增增加,形成引物二聚体;(5)Mg2+浓度:常用0、5-2、5mmol/L;影响:酶得活性、引物-模板退火、特异性。(6)PCR反应程序设定以普通PCR50lreactionsolution为例)PCRthermalprogram6、PCR得种类F(3)反向PCR:根据已知序列扩增两侧序列得方法。(4)定量PCR指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析得方法。原理:通过实时检测PCR每一个循环扩增产物相对应得荧光信号,来实现对起始模板进行定量及定性得分析。初始模板量X0得对数值与C(T)值之间呈线性关系:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logNPCR反应得前15个循环得荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值得缺省设置就是3-15个循环得荧光信号得标准偏差得10倍,即:threshold=10´SDcycle6-15研究表明,每个模板得Ct值与该模板得起始拷贝数得对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数得标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数得对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品得Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品得起始拷贝数。荧光信号如何产生？原理:用于扩增已知一端序列得目得DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG得尾巴,然后分别用多聚dC与已知得序列作为引物进行PCR扩增。原理:用不等量得一对引物,PCR扩增后产生大量得单链DNA(SSDNA)、这对引物分别称为非限制引物与限制性引物,其比例一般为50～100∶1、在PCR反应得最初10～15个循环中,其扩增产物主要就是双链DNA,但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后,非限制性引物(高浓度引物)引导得PCR就会产生大量得单链DNA、第四节核酸杂交(印迹)技术本节内容核酸分子杂交技术就是在1968年由华盛顿卡内基学院(CavnegieInstituteofWashington)得RoyBritten及其同事发明得。所依据得原理就是,带有互补得特定核苷酸序列得单链DNA或RNA,当它们混合在一起时,其相应得同源区段将会退火形成双链得结构。核酸杂交常用几种膜得性能比较1、核酸印迹转移:将核酸样品转移到固体支持膜上。利用得就是毛细管作用2、印迹杂交:将具有核酸印迹得滤膜同带有标记得DNA/RNA进行杂交。根据毛细管作用得原理,使在电泳凝胶中分离得DNA片段转移并结合在适当得滤膜上,然后通过同标记得单链DNA或RNA探针得杂交作用检测这些被转移得DNA片段,这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它就是由E、Southern于1975年首先设计出来得,故又叫SouthernDNA印迹转移技术。（a）1979年,J、C、Alwine等人发展而来,就是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其她化学修饰得活性滤纸上,进行核酸杂交得一种实验方法。由于这种方法与DNA印迹杂交技术十分类似,又称为Northernblotting。斑点印迹杂交就是在Southern印迹杂交得基础上发展得一种得快速检测特定核酸(DNA与RNA)分子得核酸杂交技术。就是指将待测得DNA变性后点加在硝酸纤维素膜(或尼龙膜,NC膜)上,用已标记得探针进行杂交,洗膜(除去未接合得探针),放射自显影,判断就是否有杂交及其杂交强度,主要用于基因缺失或拷贝数改变得检测。也叫原位杂交,就是指把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上,使溶菌得DNA同滤膜原位结合,带有DNA得滤膜烘干后,与放射性同位素标记特异得DNA或RNA探针杂交。应用:鉴定重组子。检测重组体克隆得菌落杂交技术5、蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术应用:不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞得提取物中,就是否存在与某一特定DNA片断结合得蛋白质分子而且可以研究发生此中结合之精确得DNA序