各生理指标实验步骤.doc
上传人:王子****青蛙 上传时间:2024-09-14 格式:DOC 页数:7 大小:72KB 金币:10 举报 版权申诉
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1丙二醛(MDA)含量得测定丙二醛在酸性与高温得条件下,可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色得三甲川,在532nm处有最大光吸收。植物组织中可溶性糖与TBA得显色反应产物在450nm与532nm处也有吸收。测定时要排除可溶性糖得干扰,因此分别测定532nm与450nm处得吸光值,直接求得植物样品提取液中MDA得浓度;MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。计算公式如下:C(µmol、L—1)=6、45OD532-0、56OD450进一步算出每克样品鲜重中丙二醛得含量(µmolg—1FW)。试剂:10%三氯乙酸(TCA):10g三氯乙酸定容于100ml0、6%硫代巴比妥酸:0。6g用10%三氯乙酸TCA定容于100ml试验步骤:(1)取植物材料用液氮迅速研磨成粉,取0、2g左右材料,放入5ml离心管内.(2)加入5ml10%得三氯乙酸,提取30min后,10000r/min离心15min。(3)取上清液2ml,加入2ml0、6%TBA,混匀,在100℃水浴中煮15min,冷却,冷却后再测量。(4)分别测定532nm与450nm处得吸光值。以2ml(加TBA,水)水代替提取液作为对照管。2蛋白质含量测定--——考马斯亮蓝G—250法实验原理:考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色,当它与蛋白质结合后变为青色,前者最大光吸收在465nm,后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质一色素结合物在595nm波长下得光吸收与蛋白质含量成正比,故可用于蛋白质得定量测定。仪器与试剂:牛血清白蛋白500微克/毫升:10mg蒸馏水定溶至100ml考马斯亮蓝G-250:10mg溶于5ml90%乙醇中,加入10ml85%得磷酸,用蒸馏水定溶于100ml操作步骤:1、标准曲线得制作:取4支试管,按下表配制不同浓度得牛血清白蛋白溶液各1毫升,加入5毫升考马斯亮蓝G—250试剂,摇匀,放置2分钟后用10毫米光径得比色杯在595nm下比色。做出标准曲线。管号1234蛋白质含量(微克)050100150500微克/毫升牛血00、10、20、3清白蛋白量(毫升)蒸馏水量(毫升)1、00、90、80、7考马斯亮蓝-G2505555(毫升)2、样品中可溶性蛋白质得提取测定:称取植物叶片0、2克,用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后,过滤,取滤液l、0ml(视蛋白质含量适当稀释)于试管中,加入5毫升考马斯亮蓝G-250试剂,摇匀,放置2分钟后用10毫米光径得比色杯在595nm下比色,以空白管调零,测定吸光度。根据吸光度查标准曲线,求出样品中得蛋白质含量。3、结果计算样品中得蛋白质含量(mg/g)=(C·Vt)/(1000Vs·WF)式中:C--查标准曲线值(ug)Vt一提取液总体积(ml)WF一样品鲜重(g):Vs一测定时加样量(ml)。3脯氨酸(Pro)含量得测定药品:3%得磺基水杨酸:3g磺基水杨酸溶在100ml水中.2、5%酸性茚三酮显色液:冰乙酸与6mol/l磷酸以3:2混合,作为溶剂进行配制:即2.5g茚三酮溶解在60ml冰乙酸与40ml磷酸中,磷酸就是16、4ml与23、6ml水中。脯氨酸标准溶液:称取25mg脯氨酸,用蒸馏水定溶至250ml.1、标准曲线制作(1)取4支具塞刻度试管按下表加入各试剂.试管号0246脯氨酸标准溶液(ml)00、20、61、0水(ml)1、00、80、40冰乙酸(ml)1111茚三酮显色液(ml)1、51、51、51、5脯氨酸含量(µg)02610混匀后在沸水中加热20min.(2)取出冷却后向各管加入5ml甲苯充分振荡,以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管为对照在520nm波长下比色。(3)以消光值为纵坐标,脯氨酸含量为横坐标,绘制标准曲线,求线性回归方程。2、样品提取测定(l)提取:剪碎叶片0。2g,置于大试管中,加入5m13%磺基水杨酸溶液,管口加盖保鲜膜,于沸水浴中浸提l0min。(2)取出试管,待冷却至室温后,吸取上清液2ml,加2m1冰乙酸、2m1水与4ml显色液,于沸水浴中加热40min,下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取与比色。以甲苯为对照从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度,按下式计算样品中脯氨酸含量脯氨酸含量(µg•g—1)(鲜重)=(C·V)·(a·W)—1式中:C一提取液中脯氨酸含量,由标准曲线求得;V一提取液总体积(ml);a一测定时所吸取得体积(ml):W一样品重(g)4相对电导率得测定1、取已处理得叶片,用打孔器取小圆叶片20片(或称取0。5克),放入小烧杯中,每个处理三次重复。2。向烧杯中各加入25ml蒸馏水浸半小时。3.用电导仪测各个处理松针外渗液