转基因植物中外源基因的高通量检测方法研究的中期报告引言转基因技术是以基因工程技术为基础，将外源基因导入目标生物体内，使目标生物在其遗传信息中获得新的基因，从而获得新的性状和功能。因此，转基因技术已经成为现代生物技术领域中最具前景的发展方向之一。然而，随着转基因技术的不断发展和应用，转基因制品的安全性和质量等问题也逐渐受到重视，其中最重要的问题就是外源基因的检测。外源基因的检测是转基因制品质量控制的重要环节，也是社会公众普遍关注的问题。在目前的转基因生产中，常见的检测方法包括酶联免疫吸附测定法、聚合酶链反应法、芯片技术等。虽然这些方法都能够测定目标植物是否存在外源基因，但是这些方法存在一些问题，如成本昂贵、检测时间长、检测的准确率低等。为了解决这些问题，本课题研究一种新的外源基因检测方法，即基于高通量测序技术的转录组分析方法。该方法可以同时检测目标植物中所有外源基因的表达情况，具有高效、快速、准确的优点。本报告主要介绍了该研究的实验设计、方法和初步结果。实验设计实验对象：本次实验选取转Bt棉（一种含有Bt毒素外源基因的棉花品种）和野生棉花作为对照组。实验流程：1.植物RNA提取：将已经收获的棉花干细胞样本分别进行RNA提取，利用RNA纯化试剂盒清洗提取出的RNA。2.转录组测序：将提取的RNA样品送入高通量测序机进行转录组测序。3.RNA-Seq数据分析：利用生物信息学分析软件比对已知外源基因、定量和表达差异分析。4.获得目标外源基因的定量和表达差异数据：根据测序数据计算出外源基因RNA数量，以及不同样品之间外源基因RNA数量的差异。方法1.RNA提取用三个不同的组织分别提取RNA：转Bt棉叶片、转Bt棉根系和野生棉花。我们使用RNAzol(Invitrogen)试剂来提取RNA，根据使用说明操作。2.转录组测序RNA浓度和质量被检测后，使用NEBNext®Ultra™DirectionalRNALibraryPrepKitforIllumina®(NEB，USA)建立测序文库。对获得的文库进行评估，如库容量、大小分布和文库质量。对构建的文库进行测序，获得高通量的RNA测序数据。3.RNA-Seq数据分析使用SOAPaligner/SOAP2软件软件比对转录组测序数据到参考基因组，并计算测序量。使用RSEM软件对外源基因进行定量分析，并使用DEseqR包对基因差异表达进行分析。利用生物信息学分析软件进行注释，以及外源基因的定量和表达差异分析。初步结果我们对转录组测序数据进行了分析，发现转Bt棉中有799个与轮虫杆菌杀虫毒素相关的基因表达，而野生棉花中不存在这些基因。在这些基因中，有204个基因高度表达，它们是所有外源基因中表达量最高的。这些数据表明，转录组测序可以有效地定量和分析目标植物中的外源基因表达情况，为外源基因快速、准确和高通量的检测提供了重要的信息。结论本研究采用高通量测序技术对转基因棉花中的外源基因进行了定量和表达差异分析。初步结果表明，转录组测序可以高效、快速、准确地检测目标植物中所有外源基因的表达情况。因此，该方法可以作为一种新的外源基因检测方法，为转基因制品质量控制提供重要的技术支持。