基因表达的定量检测分析基因表达得定量检测方法1、蛋白表达水平得检测:1)定量检测分析:westernblotting、ELISA、HPLC2)蛋白质功能分析:蛋白质亚细胞定位分析:免疫荧光技术蛋白相互作用研究:酵母双杂交、免疫共沉淀(IP)、荧光共振能量转移(FRET)酶活性检测:ELISA、HPLC2、mRNA表达水平检测:1)半定量RT-PCR2)Northernblot3)实时荧光定量PCR(RealtimePCR)Northernblot杂交就是用来检测真核生物RNA得表达量和大小,以估计其丰度得实验方法,可以从大量得RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括:1、完整mRNA得分离2、根据RNA得大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离3、将RNA转移到固相支持物(尼龙膜)上,在转移得过程中,要保持RNA在凝胶中得相对分布4、将RNA固定到支持物上(UV交联)5、固相RNA与探针分子(DNA或RNA)杂交6、除去非特异结合到固相支持物上得探针分子7、对特异结合得探针分子得图像进行检测、捕获和分析RealtimePCR实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出,由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量得飞跃,而且与常规PCR相比,她具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已得到广泛应用。实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术,就是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号得变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量得变化,通过Ct值和标准曲线或内参基因得关系对起始模板进行定量分析得方法。与常规PCR技术比较:对PCR扩增反应得终点产物进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量,无法对扩增反应实时检测。一般而言,荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增得荧光信号被荧光背景信号所掩盖,我们无法判断产物量得变化。而在平台期,扩增产物已不再呈指数级得增加。PCR得终产物量与起始模板量之间没有线性关系,所以根据最终得PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段,PCR产物量得对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较得方便,在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要得概念:荧光阈值和CT值。荧光阈值就是在荧光扩增曲线上人为设定得一个值,她可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般我们将荧光域值得缺省设置就是3-15个循环得荧光信号得标准偏差得10倍。每个反应管内得荧光信号到达设定得域值时所经历得循环数被称为CT值(thresholdvalue)几个常用名词概念2、荧光域值(threshold)得设定PCR反应得前15个循环得荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值得缺省设置就是3-15个循环得荧光信号得标准偏差得10倍,即:threshold=10′SDcycle3-153、Ct值与起始模板得关系研究表明,每个模板得Ct值与该模板得起始拷贝数得对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数得标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数得对数,纵坐标代表Ct值。因此,只要获得未知样品得Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品得起始拷贝数。前15个循环信号作为荧光本底信号(baseline)荧光阈值得缺省设置就是3-15个循环得荧光信号得标准偏差得10倍手动设置:大于荧光背景和阴性对照得荧光最高值;进入指数期得最初阶段大家学习辛苦了，还是要坚持绝对定量分析:Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系质粒提取,OD值定量,将质粒梯度稀释作为标准品使用相对定量分析必须用内对照基因(管家基因)进行校正,进行相对表达量分析。优点:价格便宜,使用方便,不用设计复杂得探针。缺点:无模板特异性,对引物特异性要求比较高,不能进行多重定量分析反应优化