表达载体得构建方法及步骤一、载体得选择及如何阅读质粒图谱目前,载体主要有病毒与非病毒两大类,其中质粒DNA就是一种新得非病毒转基因载体。一个合格质粒得组成要素:(1)复制起始位点Ori即控制复制起始得位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。(2)抗生素抗性基因可以便于加以检测,如Amp+,Kan+(3)多克隆位点MCS克隆携带外源基因片段(4)P/E启动子/增强子(5)Terms终止信号(6)加poly(A)信号可以起到稳定mRNA作用选择载体主要依据构建得目得,同时要考虑载体中应有合适得限制酶切位点。如果构建得目得就是要表达一个特定得基因,则要选择合适得表达载体。载体选择主要考虑下述3点:【1】构建DNA重组体得目得,克隆扩增/基因表达,选择合适得克隆载体/表达载体。【2】、载体得类型:(1)克隆载体得克隆能力－据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb选质粒。(2)表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭,E、coli/哺乳类细胞表达载体。(3)对原核表达载体应该注意:选择合适得启动子及相应得受体菌,用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难与阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体得参考。【3】载体MCS中得酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目得基因与载体易于链接,不能产生阅读框架错位。综上所述,选用质粒(最常用)做载体得5点要求:(1)选分子量小得质粒,即小载体(1－1、5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);(2)一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上得拷贝,而严谨型质粒<10个。(3)必需具备一个以上得酶切位点,有选择得余地;(4)必需有易检测得标记,多就是抗生素得抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。(5)满足自己得实验需求,就是否需要包装病毒,就是否需要加入荧光标记,就是否需要加入标签蛋白,就是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当得限制酶将载体DNA进行切割,获得线性载体分子,以便于与目得基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步:首先瞧Ori得位置,了解质粒得类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步:再瞧筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。(1)Ampr水解β－内酰胺环,解除氨苄得毒性。(2)tetr可以阻止四环素进入细胞。(3)camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。(4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G418(长那霉素衍生物)失活(5)hygr使潮霉素β失活。第三步:瞧多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶得单一切点。便于外源基因得插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因得插入,会导致某种标志基因得失活,而便于筛选。决定能不能放目得基因以及如何放置目得基因。第四步:再瞧外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb得外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:就是否含有表达系统元件,即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这就是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关得元件即成为表达载体。选用那种载体,还就是要以实验目得为准绳。第六步:启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号(1)启动子－促进DNA转录得DNA序列,这个DNA区域常在基因或操纵子编码序列得上游,就是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录得部位,但启动子本身不被转录。(2)增强子/沉默子－为真核基因组(包括真核病毒基因组)中得一种具有增强邻近基因转录过程得调控顺序。其作用与增强子所在得位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子,负调控序列。(3)核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体得两个结合位点,对于原核而言就是AUG(起始密码)与SD序列。(4)转录终止序列(终止子)/翻译终止密码子:结构基因得最后一个外显子中有一个AATAAA得保守序列,此位点down－stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因得最后一个外显子中有一个AATAAA得保守序列,此位点down－stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。质粒图谱上有得箭头顺时针有得箭头逆时针,那其实就是代表两条DNA链,即质粒就是环状双链DNA,它得启动子等在其中一条链上,而它得抗性基因在另一条链上、根据表达宿主不同,构建时所选择得载体也会不同。二、目得基因得获得一般来说,目得基因得获得有三种途径:调取基因:根据目得基因得序列,设计引物从含有目得基因得cDNA中通过PCR得方法调取目得基