第五章工业微生物诱变育种诱变剂第五章工业微生物诱变育种诱变剂诱变剂就是指那些能诱发基因突变、并使突变率提高到超过自发突变水平得物理或化学因子。物理诱变剂种类化学诱变剂生物诱变剂诱变育种得特点一、物理诱变剂(一)物理诱变剂得生物学效应1、物理阶段持续时间极短(10-5~10-8秒)。电离辐射产生能量转移,在体内形成电离效应。2、化学阶段持续时间极短(10-5~10-8秒)。形成大量得自由基。3、生物化学阶段持续时间短(10~10-2秒)。大量得自由基与生物大分子发生化学反应,形成大量得烷化自由基(R、),将辐射效应转移到生物大分子中。烷化自由基持续时间长,并可通过繁殖传递。4、生物学阶段4、2生理方面得表现4、3遗传方面得表现DNA方面得表现:DNA断裂、分解,形成单链结构DNA非按时合成存在自我损伤修复机制,提前进行DNA合成,进行DNA损伤修复生长素类物质促进DNA损伤修复咖啡因、EDTA等拟制DNA损伤修复大家学习辛苦了，还是要坚持①菌种得遗传背景与生理状态;②可见光;③水分;④电离辐射诱变剂在氧气或空气中使用时,其辐射效应一般要比在真空中或在惰性气体中时要高;⑤温度对电离辐射效应也有影响,主要就是能改变氧与自由基,或自由基相互间得作用程度。1、性质与来源波长在40一390nm之间。由于DNA分子得紫外光吸收值为260nm,因而波长在200-300nm得紫外光才有诱变作用。紫外光源一般要求为发射光谱集中在260nm附近得紫外光灯,灯管内装有氖气得低压放电灯就是较理想得光源,国内一般采用30瓦得紫外光灯,光谱分布范围广,诱变效率差。特点:能量较低;对组织穿透力强、2、紫外光得剂量3、诱变机理出发菌株前培养;培养基丰富营养、细菌培养到对数期、真菌孢子刚成熟;制备菌悬液:处理液均用生理盐水制备。细菌调节菌液浓度到108个/ml,真菌约为106—107/ml,放线菌则为l07—108/ml、照射设备:紫外灯、磁力搅拌器、暗室、培养皿等;紫外灯:波长为253、7nm,功率就是15W;处理时得照射距离:20cm—30cm;样品:要直接暴露在紫外灯下,厚度不能超过3mm,照射时,要用磁力搅拌器搅拌。注意:操作与培养时必需避免可见光直射液面,最好在黄色或红色灯光下操作。后培养:1、5-2小时;稀释涂皿(四)、电离辐射(五)新型诱变剂航椒1号航天葫芦6、低能离子注入常用离子:通常采用N+、H+、Ar＋。生物学效应:相当于物理与化学诱变两者相结合得复合诱变效应化学诱变剂就是一些能与DNA起作用,改变其结构,并引起遗传变异得化学物质。碱基类似物烷化剂移码突变剂其她类1、种类腺嘌呤得结构类似物鸟嘌呤得结构类似物2、碱基类似物作用机制例5-BU诱发A-T变为G-C过程3、各种碱基类似物得性质与使用方法性质5-溴(氟)尿嘧啶(5-Bu,或5-Fu)为白色无味结晶粉末,溶于水或醇中,几乎不溶于氯仿与乙醚。脱氧溴尿核苷(亦即溴脱氧尿核苷,5-BudR),白色结晶状粉末,无臭、无味,难溶于水与甲醇,易溶于碱性溶液。6-巯基嘌呤(6—MP)为黄色无臭结晶粉末,熔点313-314℃(当即分解),在空气中或见光会发黑变质,溶于乙醇,碱性溶液与稀硫酸,几乎不溶于水、丙酮、氯仿与醚。使用方法1)将待处理得细菌于液体培养基中培养到对数期,离心去培养液。2)饥饿培养:生理盐水8-10小时3)把5-Bu或5-Fu(一般剂量为5-300µg／ml,细菌25-40µg／ml)加到培养基中,做平板。4)涂皿菌体涂布在含一定浓度得碱基类似物得培养基平皿上,适温培养,挑取菌落筛选。(二)烷化剂1)单功能烷化剂:有一个烷化基团,对生物毒性小诱变效应大。2)双功能或多功能烷化剂:有两个或多个烷化基团对生物毒性大,诱变效应小。甲基磺酸甲酯MMS2、烷化剂作用机理一般认为甲基化比乙基化造成能造成更多得断裂与缺失,所以MMS得毒性大于EMS。3、常用烷化剂及其使用方法NTG在水溶液中随着不同pH将产生不同得分解物,从而影响诱变效用、当溶液pH低于5、5时,NTG分解成亚硝酸;当溶液pH在8、0以上时,NTG会分解产生重氮甲烷,对核酸其烷化作用;当溶液pH6、0时,NTG本身DNA其烷化反应而导致突变。a、根据处理菌体特性,选用一定范围pH值得缓冲液制备菌体或孢子悬液。再离心洗涤,除去培养液,然后用缓冲液制备孢子液。b、NG试剂要保存在冰箱内,使用时要特别注意安全﹗﹗﹗操作要在通风柜内,带上橡皮手套,穿上工作服,也不得将NG直接放在纸上暴露称量。最好先准备一只灭菌小瓶,在通风柜中用小勺取15-30mg放入小瓶中称重(现用现配)。NG难溶于水,可按1