DON诱导望水白cDNA文库构建与基因表达分析的开题报告开题报告一、研究背景及意义水稻是世界上最重要的农作物之一，它是数亿人口的主要食物来源。然而，水稻生长过程中经常会受到不同的环境胁迫，如干旱、高盐、低温等，这些胁迫不仅影响水稻的生长和发育，还降低了水稻的产量和品质。为了对抗这些胁迫，水稻通过启动一系列的适应性反应来维持自身生命活力和生长发育。因此，对水稻的响应和适应力机制进行深入研究，有助于提高水稻的抗逆性和产量。白菜叶病毒(Donacaula蛾十二病毒,DON)是一种在亚热带和热带地区广泛流行的水稻病毒病，其主要病症包括：叶面呈现黄化，卷曲，严重时会导致水稻死亡或降低产量。虽然在水稻对抗DON的响应机制已经有所研究，但是对于明确DON与水稻宿主因子相互作用的分子机制和遗传调控尚不十分了解。因此，本研究计划使用高通量技术分析水稻在DON胁迫下的转录组变化，筛选出与DON胁迫相关的关键基因。同时，为了更深入地研究DON的致病机理，我们构建了一个cDNA文库，其中包含DON胁迫下叶片组织的全长cDNA，希望能够发现与DON相关的新基因。本研究对于一方面进一步加深我们对DON致病机理的认识，另一方面有助于培育更多的抗病水稻品种。二、研究内容和方法1.文库构建将DON胁迫下的叶片组织抽取总RNA，进行mRNA的纯化和转录反应，并且加入适当的接头和途中子，得到反向转录的cDNA。通过PCR扩增并纯化，获得约1kb的全长cDNA。将这些cDNA序列克隆到pGADT7-Rec含有AD标签的表达载体中，构建一个cDNA文库。2.文库筛选采用酵母双杂交技术筛选出与DON胁迫相关的基因。将构建好的cDNA文库与含有BD标签的合子栓菌素激活因子表达载体进行转化，然后进行抗生素筛选和酵母栓菌素双胞子菌平板培养。通过筛选，鉴定出与DON相关的正反应蛋白复合物，将这些cDNA克隆回到pGADT7-Rec表达载体中，进一步筛选出DON胁迫下的关键基因。3.基因表达分析通过实时荧光定量PCR技术分析DON胁迫下关键基因的表达变化。首先将不同处理的cDNA进行分离和纯化，然后通过荧光定量PCR反应，得到相应基因的荧光信号。通过计算不同处理组之间的荧光对数差，可以获得基因表达的差异。同时，我们还将利用基因芯片技术来确定在DON胁迫下与关键基因表达有关的代谢通路和细胞信号通路。三、研究预期结果1.构建DON胁迫下水稻叶片组织的全长cDNA文库；2.通过酵母双杂交技术鉴定出与DON胁迫下水稻叶片组织相关的基因；3.确定DON胁迫下与该关键基因表达相关的代谢通路和细胞信号通路；4.揭示DON原理及其与水稻相互作用的分子机制。四、研究进度计划本研究计划于2022年6月开始，预计至2024年6月完成，具体进度如下：2022.6-2022.12：RNA提取、cDNA逆转录和文库构建；2023.1-2023.6：酵母双杂交实验和文库筛选；2023.7-2023.12：基因表达分析和通路分析；2024.1-2024.6：总结分析并撰写论文。五、参考文献王晓鹤,邓根兴,葛洛平.水稻生物学[M].北京:高等教育出版社,2006.SinghA,KanwarP,PandeyA,etal.ComprehensivegenomicanalysisandexpressionprofilingofRiceWhitebackedPlanthopper,Sogatellafurcifera[J].PLoSONE,2017,12(3):e0173234.FukudaN,MatsudaT,TomitaR.DevelopmentalandSaltStress-SpecificExpressionofHbCIPKsEncodingTonoplast-TargetingCalciumSensorProteinsinReconstitutedArabidopsisCells[J].PLoSONE,2015,10(9):e0137393.