用15N同位素测定生物固氮的方法可分为间接和直接两种方法，间接测定又包括15N富集同位素示踪法和用15N自然丰度变异法，该两种方法均需要参比作物或已知参比值以确定生物的固氮量，因此一般有很大的不确定性，固氮量的确定只能是半定量的；直接测定法是将联合固氮系统暴露在15N2气氛围中，通过直接测定15N吸收同化而确定其固氮的方法，这种方法是一种定量测定生物固氮的方法，但需要将固氮系统封闭在一个气密的固氮暴露箱内，操作比较复杂，另外标记同位素花费较高，因此长期以来在研究应用并不十分广泛，然而随着DNA或RNA探针技术的发展，直接固氮测定法在测定固氮和确定固氮微生物的基础研究方面将展示广阔的应用前景。1.15N2的制备、纯化和存储15N2可由15N标记铵盐在碱性条件下和次溴酸盐反应制得，即试剂用Bremner法制备次溴酸盐一碘溶液。将400克NaOH溶解到60毫升水中，将此NaOH溶液的一半加入带有温度计并以碎冰冷却的一公升Ernlemeyer烧瓶中，将120毫升Br2缓慢地、逐滴地加入,猛烈搅拌,使温度保持在5℃以下，再加入另一半NaOH溶液，将此混合液搅拌几分钟，在冰箱中贮存一个星期之后,将沉淀的NaBr结晶与上清液分开，用等体积的KI溶液（0.2%，w/v）稀释上清液。1毫升这种溶液可以使5-6毫克NH3+氧化成N2。100毫升水中依次溶解5克KMn4和2.5克KOH,制成KMNO4-KOH溶液，100毫升硫酸溶液（5%，v/v）中溶解20克NaSO4,得到NaSO4–H2SO4溶液。装置制备装置如图所示。各玻璃部分间是通过涂抹硅油的磨口接合并用耐压管道连结。图中Y和Z分别为KMnO4-KOH和Na2SO4-H2SO4吸存器，15N2气贮存瓶（V）与另一只瓶子（W）连结,可以防止空气回流到V。选用大小不同的圆底烧瓶,可以使X、Y和Z部分的容积,比试剂在一个大气压下产生的15N2的总体积稍微大一些，这时装置内部的气压应该小于大气压。步骤在烧瓶X中放入(15NH4)2SO4，分液漏斗中加入相应数量的次嗅酸盐一碘溶液。在Y和Z中分别加入KMnO4-KOH溶液和Na2SO4-H2SO4溶液,约到其容积的1/10即可。用真空泵从处抽气,使X的真空度达到大约10-2-10-3托，关闭活栓a，然后打开分液漏斗的活栓,将次嗅酸盐一碘溶液滴入X中,产生15N2气，在产气过程结束后，将蒸馏水加入分液漏斗,并使蒸馏水滴入烧瓶X中，当瓶中15N2的压力稍大于大气压力时,滴漏过程便自动停止。打开活塞b、c、d、e和f,关闭活塞g,从活塞f处对Y和Z抽真空,关闭活塞c,打开活塞a,小心地打开活塞b使X瓶中15N2的进入Y,待分液漏斗中的水完全置换出X瓶中的15N2气体后,关闭活塞b。关闭活塞e并打开活塞c,从处放水进入Y中，置换15N2气体使其转至烧瓶Z,关紧活塞d,由活栓f连通Z和V,并打开活塞c和g，从处加水至Z中。这样纯化后的15N2气体就被转移至事先装满水的贮存瓶V中,从V排水至W瓶,这种布置可阻止空气从活栓h处回流15N2气完全转移到瓶V中之后,将它和瓶W一起,从活栓f和g之间,与整个装置系统开。图.制备15N2的装置。X，15N2发生器；Y，KMnO4（5%，w/v）-KOH（2.5%）吸存器；Z，Na2SO4（20%）-H2SO4（5%,v/v）吸存器；V，15N2存储瓶；W，排水存储瓶。1.蒸馏水，2.次溴酸盐-碘溶液；3（15NH4）2SO4；4.KMnO4-KOH溶液;5.Na2SO4-H2SO4。2.固氮测定装置和流程固氮生长箱的室C与A和B通过涂抹硅油的磨砂平边接合在一起，在D、E、F、G和H管口有聚四氟乙烯栓塞阀，整个容器保持气密状态。15N2依次通过碱性高锰酸钾溶液和酸性硫酸钠溶液并F口引入玻璃容器。在15N2引入前，气密容器先用真空泵抽真空，当水下的泥土中由于负压冒出气泡时，继续且保持几分钟后，然后引入15N2使容器中的压力达到大气压。为了保持作物的生理条件，使用空气泵通过二氧化碳缓冲溶液循环密封室上端的（进口D和出口E）的大气相。缓冲溶液由混合物组成K2CO3（1/20M）-KHCO3（1/10M），缓冲液的构成比例可以调节，以便顶部的CO2浓度维持在800ppm。图.15N2暴露气密性生长室。A茎室；B，中间室；C，根室；D大气循环进口；E，大气循环出口；F，15N2气体入口；G，气体采样器附件；H，排水孔。3.同位素化学计量关系设样品中N来自大气标记Natm和非大气非标记Nnon两部分组成，其15N原子百分超为Esample，且大气标记15N的原子百分超为Eatomsphere，则由同位素质量平衡，有则，样品中的N来自大气标记N的比例为固氮的N量为在整个固氮