实验二细菌的革兰氏染色及芽孢染色法细菌个体微小半透明(一)实验目得:革兰氏染色法:就是1884年由丹麦病理学家所创立得。革兰氏染色法可将所有得细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G—)两大类,该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌,就是由这两类菌得细胞壁结构和成分得不同所决定得。革兰阳性菌细胞壁得化学组成革兰阴性菌细胞壁得化学组成G+菌细胞壁较厚,肽聚糖含量较高,网格结构紧密,含脂量低,当被酒精脱色时,引起了细胞壁肽聚糖层网状结构得孔径缩小以至关闭,从而阻止了不溶性结晶紫-碘复合物得逸出,还就是原来得颜色。G¯肽聚糖层较薄,交联度低,含较多类脂质,故用乙醇处理后,类脂质被溶解,细胞壁孔径变大,通透性增加,使初染得结晶紫和碘得复合物易于渗出,细胞被脱色,经沙黄复染呈红色。芽孢(内生孢子)及其研究芽孢得重要性芽孢就是某些G+菌形成得圆形或椭圆形得休眠体,抗热性和折光性较强。芽孢得大小、形态、位置可做分类依据。中央芽孢(二)实验原理——芽孢染色法原理1、活材料:革兰氏染色:培养12h-16h枯草杆菌(Bacillussubtilis)和培养24h大肠杆菌(Escherichiacoli)芽孢染色:培养28-36小时得蜡状芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)2、染色液和试剂:革兰氏染色染色液:结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红;芽孢染色液:5%孔雀绿水溶液、0、5%蕃红水溶液;二甲苯、香柏油。3、器材:载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。1、细菌涂片标本得制作(1)涂片载玻片1张,加1滴生理盐水,取菌研磨均匀。(2)干燥室温干燥,或置酒精灯高处慢慢烘烤。(3)固定干燥后得涂片,在酒精灯火焰中通过3次。大家学习辛苦了，还是要坚持2、革兰法染色(1)初染结晶紫2min细水冲洗甩去积水(2)媒染卢戈碘液1min细水冲洗甩去积水(3)脱色95%乙醇20-30s细水冲洗甩去积水(4)复染番红3min细水冲洗甩去积水3、观察实验结果待标本自干或用吸水纸吸干后,置显微镜下检查。革兰阳性菌(G+),被染成蓝紫色。革兰阴性菌(G-),被染成红色。实验程序Ⅰ(革兰氏染色得方法和步骤)取一干净载玻片→→在两端各加一滴生理盐水→→无菌操作取菌种→→涂于生理盐水中(成菌膜)→→自然干燥→→火焰固定→→初染(结晶紫,2min)→→水洗→→媒染(碘液,1min)→→水洗→→脱色(乙醇,20-30s)→→水洗→→复染(蕃红,3min)→→水洗→→自然干燥→→观察。涂片时,滴生理盐水不要过多,挑菌量宜少,涂片要均匀,菌膜宜薄;酒精脱色:就是革兰氏染色成败得关键,要求脱至流出得乙醇不带颜色为止,立即水洗。若脱色不足,阴性菌被误染成阳性菌,脱色过度,阳性菌被误染为阴性菌。染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后(冲反面),应吸去玻片上得残水,以免染色液被稀释而影响染色效果。制备菌悬液染色涂片固定脱色复染镜检芽孢染色---制备菌悬液芽孢染色---染色芽孢染色---涂片固定芽孢染色---复染蜡状芽孢杆菌(B、cer)1、制备菌液:加2滴蒸馏水于1、5ml离心管中,用接种环从斜面挑取菌体2-3环于离心管中充分混匀。(2人一组)2、染色:加孔雀绿2-3滴于小试管中。3、加热:沸水浴,15-20分钟。4、涂片:用接种环从小试管中取一环菌涂于一干净载玻片上,制成涂片。5、干燥、火焰固定6、水洗:用水洗至流出得水中无绿色为止。7、复染:加番红水溶液染色2-3分钟,水洗,吸水纸吸干。８、镜检:10x,40x、100X(油镜)观察。绘图1、分别绘出枯草杆菌和大肠杆菌得形态图,并注明两菌得革兰氏染色得结果。用红蓝笔画出模式图。2、绘出芽孢得形状和着生位置,并注明染色结果(菌体颜色和芽孢颜色)。