激光共聚焦显微镜原理与操作激光扫描共焦显微镜技术及应用激光扫描共焦显微镜技术二、原理原理小结:Confocal利用放置在光源后得照明针孔与放置在检测器前得探测针孔实现点照明与点探测,来自光源得光通过照明针孔发射出得光聚焦在样品焦平面得某个点上,该点所发射得荧光成像在探测针孔上,该点以外得任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说就是共轭得,因此被探测点即共焦点,被探测点所在得平面即共焦平面。计算机以像点得方式将被探测点显示在计算机屏幕上,为了产生一幅完整得图像,由光路中得扫描系统在样品焦平面上扫描,从而产生一幅完整得共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动,将样品新得一个层面移动到共焦平面上,样品得新层面又成像在显示器上,随着Z轴得不断移动,就可得到样品不同层面连续得光切图像。激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术大家学习辛苦了,还就是要坚持激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术得应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用3、GFP绿色荧光蛋白GFP得得发现:60年代,Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren),该蛋白与钙与肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取得颗粒都呈绿色,后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,后经研究表明,在水母体内Ca2+与肠腔素与水母发光蛋白结合后,水母发光蛋白产生蓝色荧光,GFP在蓝光得激发下,产生绿色荧光。将外源基因与GFPDNA相连,GFP可作为外源基因得报告基因实时监测外源基因得表达、激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用荧光探针激发波长发射波长KdFLuo3-AM,K+,dextran506nm525nm390nMFluo4506nm525nmCalciumGreen-1507nm530nm190nMCalciumGreen-2507nm535nm550nMFurared420/480nm637nm140nMOregonGreen488494nm520nm20,000nMCalciumCrimson583nm602nm328nMIndo-1356nm405/458nm230nMFura-2340/380476nm145nM程序化测量:用timelapse中得编程按钮可进行不同时间序列得扫描测量。F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+浓度绝对测量1)单波长公式法Fluo3:530nmKd=450nM[Ca2+]I=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin:细胞内无钙时得荧光强度(MnCl2)Fmax:细胞内钙饱与时得荧光强度(A23187)测量时切记细胞内静息Ca2+浓度得相对荧光强度值不能太低(F值不低于40)细胞内生理Ca2+浓度值(10-8-10-7M)细胞内Ca2+超载浓度值(基础Ca2+浓度得10倍左右)2)标准曲线法根据仪器条件与负载条件,以不同Ca2+浓度得Buffer(EGTA-Ca2+)做标准曲线,横轴为Ca2+浓度,纵轴为荧光强度3)比例荧光得测量、双波长(比例荧光:ratio)Indo1(360,420/480),fura2(340/380,440)[Ca2+]I=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光扫描共焦显微镜应用细胞器得Ca2+测量1、线粒体内游离Ca2+测量Fluo-3+TMRM(线粒体荧光探针,红色)2、特异定位得重组水母发光蛋白水母发光蛋白与Ca2+结合后发蓝光用含有水母发光蛋白与含有特定细胞器蛋白得表达载体转染细胞,可测定亚细胞器内得游离Ca2+变化目前已商品化得探针可检测:线粒体、内质网、细胞核内得游离Ca2+,因生物发光很弱不能使用Confocal检测细胞内游离Ca2+测量得应用钙得特性1、细胞内外得电化学梯度103-104倍2、细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加,导致胞内钙明显升高3、细胞内钙为细胞激活“开关”细胞内钙得生理作用1、肌肉得兴奋收缩-收缩偶联2、神经递质得释放3、学习记忆得增强4、卵子受精5、细胞分裂与再生6、细胞调亡7、细胞间通讯8、细胞信号传