产气荚膜梭菌检验目录1、概述2、生物学特性（菌体形态学特征、培养特性和抵抗力）3、毒素与分型4、培养基和试剂5、检验程序6、说明1、概述产气荚膜梭状芽孢杆菌又称魏/卫氏梭菌分布：自然界广泛存在(创伤感染）。易污染食品：动物性食品原料食品加热后未及时冷却，所含耐高温而残余的产气荚膜梭菌芽孢会迅速发芽，大量繁殖，菌数可达数10万/g，食用前又未加热，则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标是检验食品被该菌污染的程度，其重点项目是活菌数测定及证实试验。2、生物学特性1)形态与染色G+(陈旧培养物阴性菌）无鞭毛可形成荚膜和芽胞的大杆菌大小：为(1－2)μmX(2－10)μm。芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的直径，有的菌株难形成芽胞。荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基内生长时可形成荚膜。http://course.tjac.edu.cn/shouyiweishengwu/图片资料/产气荚膜梭菌.jpg2)培养特性肝片肉汤培养：－－大量产气，培养5h-6h变浑浊；牛奶培养基中生长：－－能够分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固产生大量气体，冲散酪蛋白，使其成海绵状。庖肉培养基中培养：－－产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化。普通琼脂平板上培养：－－15h－24h形成S型菌落，在营养不足或琼脂浓度高的平板上可形成锯齿状带放射条纹的R型菌落。鲜血琼脂平板生长：－－菌落周围出现双层溶血环，内层溶血完全，外层溶血不完全，好似靶状，菌落本身略带灰黄色至浅灰褐色，与空气接触30min后，有时可能逐渐变为灰绿色、甚至鲜绿色，这是本菌的特征之一。ClostridiumperfringensGrowingonBloodAgar菌落周围出现乳光浑浊带，此反应能被本菌的α抗毒素抑制。*由于发酵乳糖，菌落周围的培养基颜色发生变化*本菌不消化牛奶，不分解游离脂肪，菌落周围不出现透明环及虹彩层（肉毒梭菌可形成）。3)生化特性*发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，*液化明胶*还原硝酸盐为亚硝酸盐。*能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落*发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓‘‘暴风雨式发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。4）抵抗力A型与C型菌株的芽胞：耐热性强，煮沸1－3h，繁殖型菌体不耐热。3、毒素、酶与分型毒素：产气荚膜梭菌能产生外毒素和肠毒素。外毒素：致死毒素、坏死毒素和溶血毒素，毒性不强不耐热。肠毒素：不耐热，60℃经10min即可破坏不耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶等蛋白分解酶比较稳定。酶：纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶等这些毒素和酶促使组织分解、坏死、产气、水肿及病变扩散和全身中毒等。分型：根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成A，B，C，D，E和F六个型。A型：最常见，引起气性坏疽和食物中毒；A型最早由WelchandNuttal(1892)分离，所以叫卫氏/魏氏梭菌C型：可引起肠炎。*对人致病的主要是A、C和F型*引起食物中毒的主要是A型4、培养基和试剂4.1庖肉培养基－－产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化4.2亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）--能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐(含有柠檬酸铁胺)的琼脂中形成黑色菌落；前面分离培养和计数用4.3液体硫乙醇酸盐培养基（FT）－－大量培养该菌用4.5含铁牛奶培养基--发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓‘‘暴风雨式发酵”/“暴烈发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。观察2h，5h不发酵为阴性4.6卵黄琼脂培养基－－检查卵磷脂酶，本菌卵磷脂酶阳性，接种点（每个平板接种10点以上）的底部及其周围形成乳白色的浑浊带。4.70.1％蛋白胨水稀释剂；4.8硝酸盐还原试剂:甲萘胺液和对氨基苯磺酸液；4.9革兰氏染色液。5、检验程序检验程序—续6、说明1．活菌计数培养：1：10稀释的样品用蛋白胨水依次稀释至10-2－10-6倍，取1ml放入2个平板，分别加15mlSPS琼脂，于36℃培养24h，选取长有30—300个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。2、证实试验(1)纯培养：由平板上任取10个黑色菌落，分别接种FT培养基，于(36±1)℃培养18－24h，大量繁殖。(2)菌体形态和染色检验：用培养液涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株有卵形芽孢，位于菌体中央或近端。