重组蛋白的分离纯化基因表达体系大肠杆菌(Escherichiacoli)枯草杆菌(Bacillussubtilis)其他真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞CHO细胞动物乳腺组织鸟类输卵管组织植物组织体系选择重组蛋白的分离纯化策略针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择ProteinpurificationAboutgelfiltration分泌型战略表达重组蛋白的分离纯化策略外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。②分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶所降解。③简化了发酵后处理的纯化工艺。人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性的研究rhALR的纯化离子交换琼脂糖：离子交换介质的选择原则Whathappensinionexchange?离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作离子交换层析的基本操作阴离子交换法凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶介质的选用原则将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离凝胶层析的基本操作上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：凝胶色谱层析洗脱第1峰主要为rhALR四聚体；洗脱第2峰为目的蛋白峰，rhALR二聚体，纯度大于95%，rhALR最后得率为52%。包涵体型战略表达重组蛋白的分离纯化策略包涵体的组成当重组蛋白以包涵体形式存在时，可获得高表达、高纯度的重组蛋白，避免蛋白酶对外源蛋白的降解，但不具有生物活性。要对其进行分离纯化，就需要对包涵体进行变复性处理。然而不论以那种表达形式产生的重组蛋白。其纯化的方法都与传统的生物大分子分离方式相似。包涵体的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异。即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。由于包涵体难溶，必须首先将其溶解后才能进行蛋白纯化，可以用变性剂(尿素或盐酸胍)溶解包涵体，这样获得的重组蛋白产量虽高，却会破坏蛋白质的二级结构，需经蛋白复性才可能恢复它的生物活性。主要方法Interactionbetweenneighboringresiduesinthe6HistagandNi-NTAmatrixPurificationmechanismofrecombinantHis-taggedproteins人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化收集液进行12％的SDS-PAGE检测融合表达蛋白的分离纯化表达融合蛋白的优点(1)融合蛋白较稳定，不易被细菌蛋白酶水解。(2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽，可产生分泌型产物。(3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析，便于纯化。(4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉，释放出天然的真核蛋白质。(5)目的蛋白溶解性好，由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性。节杆菌乙内酰脲水解酶与GST蛋白融合表达及纯化GST-融合蛋白的表达和纯化流程结核分枝杆菌16kDa与GST融合表达及纯化Astrategyforhigh-levelexpressionofsolubleandfunctionalhumaninterferonaasaGST-fusionproteininE.coliScreeningofpGEX4T1/IFNa2brecombinantplasmidscontainingthecDNAsequenceencodinghIFNa2bwasperformedbyarestrictionmappinganalysisusingBglIIrestrictionAnalysisoftherecombinantGST-rhIFNa2bexpressedintheE.coliBL21straingrown37℃.Bothintracellularsoluble(A)andinsoluble(B)proteinfractionswereloadedonSDS–PAGEgels,andproteinswerestainedwithCoomassieBrilliantBlueR250.LaneMshowsthemolecularweightstandards(RPN756MW)indicatedinkiloDaltons.Lanes1and3correspondtotheproteinsamplescollectedfromanun-inducedcultureofE.coliBL21transformedwithpGEX4T-1andE.coliBL21transformedwiththepGEX4T1/IFNa2brecombinant