会计学荧光分光光度法测定药片(yàopiàn)中维生素B2的含量实验(shíyàn)原理实验(shíyàn)原理a.与紫外-可见分光度法比较，荧光(yíngguāng)分析法具有更高的灵敏度。b.选择性好。荧光(yíngguāng)法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。激发光谱：固定测量(cèliáng)波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线(qūxiàn)。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光(fēnɡuānɡ)光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光(fēnɡuānɡ)光度计采用光电倍增管作检测器。维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性(zhōngxìng)或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。维生素B2溶液在430～480nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光(bìɡuānɡ)条件下进行。光黄素实验(shíyàn)预习F-4500型荧光(yíngguāng)光度计（日本日立公司）10mL具赛试管10只，移液枪1只，100mL容量瓶2只5×10-5g·mL-1VB2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR），药用VB2试样(5×10-4g·mL-1)1.打开计算机，先接通电源开关（POWER），5秒钟后再按下XeLAMP按钮，再接通主开关（MAIN），此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作软件。2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。3.样品(yàngpǐn)测定。4.关机顺序：逆开机顺序实施操作。1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度(qiángdù)的测定：在10个干净的10mL具赛试管中，分别吸取25、50、75，100、125、150、175、200uLVB2标准溶液，用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度(qiángdù)。2.未知试样的测定:在两支10mL具赛试管中，分别移取100uL试样,用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准(biāozhǔn)系列时相同的条件，测量其荧光强度。1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。2.根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度(nóngdù)，计算出试样中VB2含量。1.解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。2.维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何(wèihé)在酸性溶液中测定？1、波长扫描（WavelengthScan）对样品进行激发波长或发射波长的扫描。点击快捷栏“Method”,显示出“AnalysisMethod”的五个命令，分别为General(常规)、Instrument(仪器条件)、Monitor(模拟监测)、processing(处理(chǔlǐ)方法)、Report(报告格式)，输入相应数据。1.1GeneralMeasurement-----选择Wavelength1.2InstrumentScanmode------输入(shūrù)扫描方式Datamode------输入(shūrù)数据采集方式EMWL------输入(shūrù)发射波长EXStartWL------输入(shūrù)激发起始波长EXEndWL------输入(shūrù)激发终止波长EXWL------输入(shūrù)激发波长EMStartWL------输入(shūrù)发射起始波长EMEndWL------输入(shūrù)发射终止波长Scanspeed------扫描速度选择Delay------延迟时间EXSlit------激发单元狭缝EMSlit------发射单元狭缝PMTVoltage------光电管负高压Response------响应速度Correctedspectra------光