一例乙型肝炎的核酸病毒检测方案一、前言乙肝是由于病毒引发炎症致使肝脏不同程度炎症坏死或纤维化的慢性肝病。引起乙型肝炎的病原体属嗜肝DNA病毒，叫乙型肝炎病毒，是乙肝患者以及携带乙型肝炎病毒者的主要传染源，传播途径主要为母婴传播、血液传播。慢性乙型肝炎患者中，百分之四十～百分之五十的患者均来源于母婴传播。第二大传播途径是性生活传播。密切接触传播也属于乙型肝炎传播途径，如通过精液和阴道分泌物传播病毒。第四个是医源性传播，比如输液、消毒不彻底、不安全注射等。乙型肝炎病毒是属于病毒性肝炎的病原体，所以它具有较强的传染性，流行性广发病率高，传播途径复杂等一些特点。乙肝病毒检测呈阳性，病程超过半年、发病日期不明确而有肝炎的患者通常为乙型病毒性肝炎患者。乙型病毒性肝炎的临床表现，一般症状较轻，容易被人忽视。轻、重者会出现乏力、恶心、食欲不振、肝区疼痛、腹胀等症状。病情重者可伴有慢性肝病面容、蜘蛛痣、肝掌、脾大，肝功能可异常或持续异常。乙肝病毒核酸检测是利用DNA检测乙肝病毒的技术方法，是判断乙肝病毒复制的常用手段。乙肝病毒核酸检测能准确的判断病毒复制情况，弥补了乙肝两对半不能准确判断病毒复制情况的不足。目前常用的HBV检测方法主要有酶联免疫法、核酸检测HBVDNA方法。本实验采用的是核酸检测法。二、设计依据（一）病毒核酸提取采用磁珠分离技术：样本制备采用磁珠捕获技术，样本在含胍盐的裂解液强力变性下病毒颗粒裂解释放出核酸，混合物经孵育后，核酸结合于磁珠表面，为结合的一些物质如盐、蛋白质及其的细胞杂质经洗涤磁珠后除去。（二）磁珠纯化技术：经磁分离和后续的洗脱步骤，吸附于磁珠的核酸被释放到洗脱液中作为PCR反应的模板。（三）扩增检测采用荧光TaqManPCR技术：模板加入PCR反应液中，转移至荧光PCR仪中进行PCR扩增，并经水解探针完成实时检测。三、设计方案（一）所需试剂：洗涤液A,洗涤液B,洗涤液C、去抑制剂、磁珠、洗脱液、内标、裂解液、反应液A,反应液B,反应液C、阴性对照、阳性对照（二）所需仪器：KHBParamiN400全自动核酸提取纯化仪、HAMILTONMicrolabSTARIVD全自动提取纯化仪、BIO-RAD实时定量PCR扩增仪、可调微量移液器（5-50μL、20-200μL、100-1000μL）、HH-2型数显恒温水浴锅、漩涡混合器、微型离心机等。（三）实际操作1.试剂的准备：将裂解液放入50-70℃水浴中至裂解液中晶体完全溶化，从-20℃的冰箱拿出内标在室温融化，将其进行裂解液的配制。2.质控品的配制：从-20℃冰箱取出阴性对照、200IU/ml的乙型肝炎病毒核酸标准品、阳性对照，平衡至至室温并放在涡旋震荡混匀，取溶液前先震荡15秒左右，再离心2-3秒；按比例加乙型肝炎病毒核酸标准品150μL和阴性对照1050μL，配制成目标浓度为25IU/ml的乙型肝炎病毒核酸标准品的质控品。在涡旋震荡仪上充分震荡混匀1min，离心、重复以上混匀步骤四次。取1.0ml质控于汇集管里，再取1.0ml的阳性对照品于汇集管里，注意配置过程中避免在汇集管中产生气泡，再取1.0ml阴性对照品于汇集管里。3.样本的稀释：成品汇集前需进行4倍稀释，加该成品400微升，再加生理盐水1200ul震荡混匀。4.样本的汇集：将血浆样品、试剂盒阴性、阳性对照和指控平孔各加入1个塑料试管1.2ml，用KHBParamiN400全自动核酸提取纯化仪进行扫码汇集。混样处理：使用全自动核酸提取工作站进行混样和混样后核酸提取。如果混样检测结果为反应性，需进行单人份/拆分检测测。全自动核酸提取工作站会对混合样本按相应混合系数等体积吸收，吸取的样本转移至汇集管内混合5.核酸提取：根据待扩增样本数配制核酸提取试剂，与其他批次样品同时检测，消耗试剂4孔，共需磁珠1024uL、去抑制剂2560uL、内标42uL、裂解液20ml、洗涤液A，B，C各12ml和洗脱液3.16ml.将汇集好的样品用全自动核酸提取纯化仪按仪器标准操作程序进行操作。按照样本数量取试剂盒中的HBVPCR反应液A、HBVPCR反应液B、HBVPCR反应液C室温融化混匀后，低速离心数秒。项目比例实际加量（μL）HBVHBVPCR反应液A;HBVPCR反应液B；72549HBVPCR反应液C=8：6:16.扩增：将反应液放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。扩增曲线开始指数生长时的PCR循环数宇起始样本的模板数有关。内标的全程使用可以监测核酸提取和扩增的全过程，避免发生检测假阴性。7.结果判定：根据PCR仪的软件进行分析，得到样本的HBVDNA检测结果，建议基线选取6～1