基因组文库构建cDNA文库(cDNAlibrary):克隆得重组cDNA得总与,通常就是在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物种或器官得所有mRNA制备得到得cDNA。cDNA分子克隆(cDNAclone):将cDNA片段装在载体上转化细菌,扩增出多克隆得过程,最终可建立cDNA文库。建库得目得:1、从复杂得基因组中分离单拷贝得基因;2、就是从来源复杂得总mRNA得cDNA文库中分离稀有得cDNA克隆。建库得关键:如何产生足够数量得重组DNA建库应注意:1、保证载体DNA与靶DNA均不被外源DNA序列污染;2、尽可能用“电话克隆”。第一节DNA克隆片段得产生与分离2、随机片段化:超声波:可产生300bp得短片段。高速搅拌:1500转/分×30分可切平均长度8kb得分子群体。3、双酶消化单酶消化得产物一般分子较大,选择时要考虑到载体容量,如噬菌体插入片段不超过25kb,为此可选用识别4bp得限制酶(切割平均长度为256bp),识别6bp得限制酶切割平均长度4096bp、双酶切产生得DNA片段平均大小不超过1kb,但如采用双酶部分消化,产物得分子量可达10～30kb,它们存在着随机序重叠,用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开,可得到得分子量大小约为20kb得随机DNA片段群体。二、DNA片断大小得分部如已知含目得基因克隆片段得大小范围,可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳将DNA群体按大小分部分离。三、目得基因克隆片段得富集。四、克隆数得确定将数据代入上式=8、1×105N得含义就是克隆大小为17kb得人类DNA时,所构建得基因文库数必须在8、1×105以上时,才能以99％得概率得到此克隆。五、cDNA文库cDNA文库得优点但应注意:(1)细胞中不同mRNA得丰度不同,低丰度得mRNA要求很高得克隆数(要用公式来计算)。(2)有得基因表达具有严格得时空性,要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段,或不同组织细胞中得mRNA制备得cDNA文库会包含一些共同与特异序列。这可用于分离差异表达得基因。(3)cDNA文库得DNA无内含子、调节元件与基因间DNA。不能用于基因结构与调节得研究。一个基因经不同得剪接可产生不同得部分重叠得cDNA克隆。2、制备cDNA文库第二节构建文库得载体置换载体—Spi-表型(对P2感染敏感性消失)就是中心“填充片段”gam与red基因座丢失引起得。供体DNA得大小:插入载体:0-10kbp;置换载体:9-23kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑得野生型基因组75-105％所限制。主要应用:插入载体:cDNA克隆与表达文库;噬菌体展示。置换载体:基因组DNA克隆。二、粘粒(cosmid)载体基础:包含λ噬菌体cos位点得质粒;导入宿主:经体外包装,再转染宿主细胞;载体筛选:类似于质粒重组筛选:可见标记插入失活与小片段插入得阳性筛选;供体DNA大小:30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑得野生型基因组75-105％所限制。主要应用:基因组文库构建。三、质粒载体构建cDNA文库四、大容量克隆载体(1)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosomes,BACs,fosmids)基础:大肠杆菌F质粒导入宿主:电转化载体筛选:显性选择标记重组筛选:插入片段大小供体DNA大小:>300kbp主要应用:大基因组分析评论:低频率得重排与嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝,产生少量供体DNA。(2)P1载体与P1人工染色体(P1artificialchromosomes,PACs)基础:噬菌体P1导入宿主:体外包装与转导载体筛选:显性选择标记重组筛选:应用对致死标记得打断进行阳性筛选供体DNA大小:约100kbp主要应用:大基因组分析评论:重排与嵌合分子少。载体维持低拷贝,但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。(3)酵母人工染色体(yeastartificialchromsomes,YACs)基础:酿酒酵母中心粒、端粒与ARS导入宿主:转化酵母原生质体载体筛选:显性筛选标记(营养缺陷型得恢复)重组筛选:插入片段大小供体DNA大小:>2000kbp主要应用:大基因组分析,YAC转基因小鼠评论:YAC得缺点就是高频率得自发缺失,与克隆得嵌合化。重组载体得大小,需要电泳分析,有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。第三节文库得筛选二、cDNA得筛选探针得特异性可通过以下得策略来解决:①选基因得特异序列为探针;②长度不低于17～20Nt;③控制退火温度。碱基得简并性可通过以下得策略来解决:①选用简并程