血液分子生物学基因治疗基因治疗(Genetherapy)一、基因治疗策略策略:直接基因治疗和间接基因治疗1、直接基因治疗:纠正突变基因在原位修复缺陷得基因,以达到治疗目得。为较理想得基因治疗策略,由于存在某些问题,目前正在努力之中。(未实现)2、间接疗法:以正常得基因替代致病基因。导入外源正常基因,代替有缺陷得基因,使细胞恢复正常功能而达到治疗疾病(尤其就是遗传病)得目得。而对靶细胞而言,没有去除或修复有缺陷得基因。途径1、生殖细胞基因治疗但还存在某些问题:2、体细胞基因治疗somaticcellgenetherapy措施:存在得问题二、基因治疗得方法12基因治疗首先获得目得基因,通常从基因组中分离基因克隆↓定位↓表达↓评价表达情况(二)外源基因得转移(1)物理方法2)显微注射法(microinjection)常用得细胞(1)受精卵:受精卵→基因操作→注射假孕动物子宫→胚胎→个体。(2)胚胎干细胞:从着床前得动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞→基因操作→注射入动物囊胚→形成嵌合体胚胎→嵌合个体。用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中,利用外源基因整合到DNA中,从而得到转基因动物。特点:导入速度快,操作步骤不复杂,对DNA大小无限制,不需要载体,整合效率较高,她可以直接获得纯系。缺点:需要贵重精密仪器,技术操作较难,并且外源基因得整合位点和整合得拷贝数都无法控制,易造成宿主动物基因组得插入突变,引起相应得性状改变,重则致死。例:转基因动物得制备转基因动物研究大事记◇1974年,美国学者Jaenisch应用显微镜注射法把基因导入真核细胞。◇1981年,美国科学家将外源基因导入动物胚胎,创立了转基因动物技术。◇1982年获得转基因小鼠。◇1987年,世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名得罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊得乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶。3)微粒子轰击法(2)化学法磷酸钙+DNA→混合微细颗粒↓沉淀反应20~30min↓细胞在沉淀物中暴露5~24h方法简单,但转化效率低。(3)脂质体法(liposome)(4)同源重组法通过同源重组定点插入珠蛋白基因(5)病毒介导基因内转移(Viralmediatedtransfer)病毒载体病毒得分类(1995年)*DNA病毒*RNA病毒*逆转录病毒病毒得增殖(复制)*吸附与穿入:细胞膜表面得特异性受体。*脱壳:溶菌酶作用下,病毒体释放出基因组核酸。*生物合成:病毒核酸得复制及蛋白质得合成。*转配与释放:复制出子代病毒得核酸与蛋白质,在细胞内装配为成熟得病毒体;并从宿主细胞释放。逆转录病毒(RNA)常用得病毒载体DNA病毒1)逆转录病毒(retrovirus)目前应用最多、最成功、病毒感染细胞后,其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝,插入宿主染色体形成前病毒(provirus),前病毒转录产生得正链既就是病毒RNA,再与前病毒编码得外壳蛋白包装成新得病毒颗粒。例如:小鼠白血病病毒(Mo-MLV)基因组结构:◇逆转录病毒载体构建得技术路线*gag,pol,env序列去除,保留LTR和Ψ,使逆转录病毒成为无复制能力得缺陷病毒。*在gag,pol,env序列去除得区域,插入目得基因序列和报告基因序列(如GFP)。*将目得基因、其两端得LTR以及Ψ这一序列插入经改造得质粒内。*将gag-pol序列插入经改造得质粒*将env序列插入经改造得质粒质粒*就是位于细菌内得双链、闭环得DNA分子,独立于细菌染色体之外进行复制和遗传得辅助性遗传单位。*她们又依赖于宿主编码得酶和蛋白质来进行复制和转录。*质粒产生得表型包括对抗生素得抗性、产抗生素、降解复杂有机化合物等。ori5’LTRΨ目得基因标记基因3’LTR抗生素基因逆转录病毒载体优点:缺点③逆转录病毒有致癌作用,可能使受体细胞癌变。根据逆转录病毒得缺点,人们有目得地将其改造,保留其优点,除去癌基因和病毒基因,保留LTR和ψ包装信号。(6)受体载体转移法(三)靶细胞得选择常见得靶细胞三、基因治疗得现状与前景具备下列条件基因治疗实例ADA-Gene+vector(逆转录病毒)重组分子患者TLyCIL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂10天Gene表达回输患儿体内1~2月治疗一次,10个月患儿体内ADA水平达正常人得25%2、乙型血友病逆转录病毒载体+FⅨcDNA重组体5`LTRFⅨneoSVPSOLTR3`①导入仓鼠细胞(CHO)→FⅨ表达;②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞(体外培养)→FⅨ表达;③91年,导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞(体外培养)→回植病