第八章配子与胚胎生物技术第一节动物胚胎移植一、胚胎移植发展历史二、胚胎移植的意义三、胚胎移植的生理学基础和原则(二)胚胎移植的基本原则(三)胚胎移植应具备的基本条件四、胚胎移植的技术程序（一）供受体准备（二）超数排卵1．母牛2、母羊（三）供体母畜的配种（四）胚胎的收集之后，否则不宜辨别卵子是否已受精。一般是在配种后3～8d，发育至4～8个细胞以上为宜。牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡早期进行收集和移植（配种后6～8d）。1.手术法收集胚胎用注射器的磨钝针头刺入子宫角顶端，注入冲洗液，然后从输卵管的伞部接取冲洗液，这种方式适用于牛、羊、兔等。由伞部注入冲洗液，在子宫角上端接取。猪和马的子宫角与输卵管接合部有一活塞状结构，用第一种方式，冲洗液不易通过，只能采用第二种方式。从子宫角上端注入冲洗液，由基部接取，或者相反。这种方式适合于各种家畜。冲洗操作，要求迅速准确，防止对伤口、生殖器官和冲洗液的污染，避免对动物有过多刺激和对生殖器官造成损伤。一般来说，术后生殖道易发生不同程度的粘连，严重时会造成不孕。这是手术法的最大缺点。冲洗之后，立即缝合伤口，宜单独饲养，注意伤口愈合情况。2.非手术法收集胚胎非手术法冲取胚胎，每侧子宫角需用冲洗液100～150ml。应用非手术法冲洗收集胚胎时，只能当胚胎都进入子宫角后进行。牛、马的胚胎用非手术法收集时，一般在配种后6～8d进行。3.冲洗液（五）胚胎的检查（六）胚胎的保存和培养放在室温条件下，胚胎只能存活10～20h。当温度降至20℃以下时，胚胎即停止发育，存活时间可以延长。胚胎在体温环境下（37℃）的培养，有一部分可正常发育，但发育持续的时间和达到的阶段也是非常有限的，一般只能持续3～4d。利用兔体（输卵管）进行活体内培养（保存），然后再取出移植至同种畜体内，在羊、猪、牛、马都已试验成功，经过长途运输，移植后妊娠产仔，但必须进行两次冲洗和移植的手术，降低了它的实用价值。冷冻长期保存牛、绵羊、山羊的胚胎经冷冻解冻后能够存活，且移植后均可受胎产仔。在冷冻前需先依次经过含有由低浓度到高浓度防冻剂的杜氏培养液，防冻剂的最高梯度为1.0～1.5mol/L。每种浓度中停留5～10min，在最后一种浓度中降温冷冻。胚胎冷冻时必须采取缓慢降温。由室温降至-5℃～-7℃，每分钟降1℃，在此温度下进行诱发结冰，然后按每分钟降0.3℃～0.5℃的速度降至-33℃～-38℃，此后可直接浸入液氮保存。解冻时不必控制升温速度，可直接放在室温条件下（20℃～25℃）或在35℃～37℃水浴中解冻。解冻后必须再把防冻剂清除掉。方法是使胚胎按相反的方向（由高浓度向低浓度）依次通过含有不同浓度的防冻剂的培养液，最后移至不含防冻剂的培养液中进行移植。牛胚胎冷冻较新的一种方法是在塑料细管中进行冷冻，一端装有胚胎和冷冻培养液，另一端为蔗糖液，解冻后随即被蔗糖液稀释，以冲淡防冻剂的含量，将塑料管直接装入移植器中，然后注入子宫。（七）胚胎的移植1.手术法移植2.非手术移植法（八）供体和受体的术后观察第二节体外受精一、发展简史直到20世纪80年代，家畜的体外受精技术才取得突破，尤其是牛的体外受精技术发展迅速。1981年Brackett等用体内成熟卵母细胞获得试管牛犊，随后Hanada等（1985）获得绵羊和山羊体外受精后代，并于1986年获得体外成熟卵母细胞体外受精的第一头犊牛。我国学者卢克焕（1987）在爱尔兰获得全体外过程的试管牛犊。二、意义三、技术程序(一)卵母细胞的获得和成熟培养3.卵母细胞成熟培养选择卵丘细胞完整，形态良好的卵母细胞进行成熟培养。培养条件是39℃，5%CO2，卵母细胞在培养皿液滴内培养约24h。(二)体外受精(三)胚胎培养第三节克隆技术一、胚胎分割（一）发展简介（二）胚胎切割技术2.胚胎预处理3.胚胎分割不同阶段的胚胎，切割方法略有差异：（１）桑椹胚之前的胚胎这一阶段胚胎因为卵裂球较大，直接切割对卵裂球的损伤较大。常用的方法是用微针切开透明带，用微管吸取单个或部分卵裂球，放入另一空透明带中，空透明带通常来自未受精卵或退化的胚胎。（２）桑椹胚和囊胚的分割对于这一阶段的胚胎，通常采用直接切割法。操作时，用微针或微刀由胚胎正上方缓慢下降，轻压透明带以固定胚胎，然后继续下切，直至胚胎一分为二，再把裸露半胚移入预先准备好的空透明带中，或直接移植给受体。4.分割胚的培养5.分割胚胎的保存和移植（三）胚胎分割技术的进展（四）胚胎分割目前存在的问题第一节动物胚胎移植2、母羊2.非手术法收集胚胎2.非手术移植法第三节克隆技术不同阶段的胚胎，切割方法略有差异：（１）桑椹胚之前的胚胎这一阶段胚胎因为卵裂球较大，直接切割对卵裂球的损伤较大。常用的方法是用微针切开透明带，用微管吸取单个或部分卵裂球，放入另一空透明带中