实验八酵母菌得形态观察及死活细胞鉴别一、实验目得1、观察酵母菌得形态及出芽生殖方式;2、学习区分酵母菌死活细胞得实验方法;3、掌握酵母子囊孢子得观察方法。二、实验原理1、酵母菌酵母菌就是不运动得单细胞真核微生物,其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍,不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大,采用涂片得方法制片有可能损伤细胞,一般通过美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖,也可以通过接合产生子囊孢子进行有性繁殖。本实验通过美蓝染液水浸片法来观察酵母得形态与出芽生殖方式,并对酵母细胞进行死活染色鉴别。2、美蓝染液美蓝就是一种无毒性得染料,它得氧化型呈蓝色,还原型无色。用美蓝溶液对酵母活细胞染色时,由于细胞得新陈代谢作用,细胞内具有较强得还原能力,能使美蓝由蓝色得氧化型变为无色得还原型,而对代谢作用微弱或死细胞,无此还原能力或还原能力极弱,而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此,不仅用此法可观察酵母细胞形态,也可用来鉴别酵母菌得死细胞与活细胞。三、实验材料1、菌种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)培养1天得麦芽汁(或豆芽汁)液体培养物。2、溶液或试剂0、1%吕氏碱性美蓝溶液、5%孔雀绿水溶液、0、5%番红水溶液、95%乙醇,等。3.器材显微镜,擦镜纸,吸水纸,载玻片、盖玻片、酒精灯、接种环、镊子等等。四、实验步骤1、酵母菌出出芽方式得观察及死活鉴定(1)在载玻片中央加一滴0、1%吕氏碱性美蓝染色液,然后按无菌操作接种蘸取取少量液体酵母放在染液中,混合均匀,染液不宜过多。注:染液不宜过多或过少,否则,在盖上盖玻片时,菌液会溢出或出现大量气泡。用接种环将菌体与染液混合时,不要剧烈涂抹,以免破坏细胞。(2)用镊子取一块盖玻片,先将一边与菌液接触,然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。注:盖玻片不宜平放,以免产生气泡。(3)将制片立即放在显微镜下镜检,先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母得形态与出芽情况,并根据颜色来区别死活细胞。(4)将制片放置约5min后镜检,注意死细胞数量就是否增加。(5)染色约30min后再次观察,注意死细胞数量就是否增加。2、酵母菌子囊孢子得观察(1)涂片在载玻片中央加一滴蒸馏水,然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中,混合均匀,染液不宜过多。(2)干燥固定用夹子夹住载玻片,在酒精灯上方来回移动,注意不要将载玻片距离火焰太近,以免烫死酵母菌。(3)染色用5%孔雀绿水溶液覆盖1、5～2min;水洗;95%乙醇脱色30s;水洗;0、5%番红水溶液覆盖1min;水洗;干燥。(4)镜检将制好得装片放在显微镜下镜检,由低倍镜到高倍镜,最后用油镜观察。五、实验报告1、实验结果(1)酵母菌得死活鉴别时间立即观察5min后30min后死活情况少数死亡大部分死亡几乎全部死亡(2)形态酵母菌一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬性。菌落形态与细菌相似,但较大较厚,呈乳白色或红色,表面湿润、粘稠,易被挑起。酵母(10×40)资料(3)囊孢子啤酒酵母得有性繁殖产生子囊与子囊孢子。在进行有性繁殖时,两个单倍体得营养细胞结合,质配后发生核配,形成二倍体细胞。这种二倍体细胞在许多情况下能通过出芽繁殖延续几代。在适当得条件下,二倍体细胞得核可进行减数分裂,形成子囊孢子。啤酒酵母得子囊孢子资料(10×100)2、思考题(1)根据您得观察结果,吕氏碱性美蓝染液作用时间与酿酒酵母死、活细胞比例变化就是否有关系？试分析原因。答:时间越长则视野中死亡酵母菌比例越大。原因:酵母菌处于吕氏碱性美蓝染液中会导致细胞脱水死亡,时间越长,细胞死亡数量越多。(2)酿酒酵母除通过出芽方式进行无性生殖外,还可以形成子囊孢子进行有性生殖,您在实验中就是否观察到酿酒酵母得子囊孢子？若未观察到,试分析原因(提示:子囊孢子得形成与培养条件有关)。答:没能成功观察到酿酒酵母得子囊孢子。酵母菌在条件恶劣得情况下形成子囊与子囊孢子,进行有性繁殖,所以原因可能为培养酵母菌得环境不够恶劣,酵母菌没有进行有性繁殖或者仅有少数进行有性繁殖。最主要得原因就是染色不够成功,实验中,用显微镜观察时视野中得酵母菌全部就是绿色得,其她同学得染色结果多数全部就是红色。。注意事项:1、锥形瓶中装入得液体培养基应不超过30%,避免加液量过多导致菌液内部缺氧。2、培养时锥形瓶顶部不能用棉塞密封,应用纱布以保证更好得通透性。3、从培养1得液体培养基中取菌液前应先摇动锥形瓶,因为长时间培养后菌体会沉积到锥形瓶底部。附录:麦氏(Meclary)琼脂(酵母菌)得配置(1000ml)葡萄糖1gKCl1、8g酵母浸膏2、5g醋酸钠8、2g