Howcanwestudyprotein?结构性质第四章蛋白质性质及研究技术氨基酸性质1.蛋白质的酸碱性质当蛋白质溶液处于某一pH值时，蛋白质解离成正离子和负离子的趋势相等，为兼性离子，即总净电荷为零，此时在电场中，蛋白质分子既不向阳极移动，也不向阴极移动，这个pH值称为蛋白质的等电点，用pI来表示。2.1蛋白质的胶体性质形成水化层形成双电层2.2蛋白质的沉淀反应盐溶：少量的中性盐，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大。原理：蛋白质吸附某种盐离子→双电层→蛋白质彼此排斥。蛋白质分子与水分子间的相互作用加强，因而溶解度提高。盐析：向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层，同时中和了蛋白质的电荷，降低了蛋白质的溶解度，从而使蛋白质沉淀。常用：以硫酸铵（中性盐）最常应用。因其溶解度大，且不易伤害蛋白质，另外还有硫酸钠、硫酸镁及氯化钠等。2.2.1盐析和盐溶法蛋白质分子表面聚集了许多水分子，当盐浓度高时，水分子被盐抽出，蛋白质的疏水区域暴露并相互结合，沉淀。2.2.2有机溶剂沉淀法2.2.3重金属盐沉淀法2.2.4生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质2.2.5加热凝固3.蛋白质分子量大小及测定方法台式高、超速离心机0.6-10万rpm差速离心密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心凝胶过滤法测相对分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量4.1蛋白质分离纯化的依据4.2根据蛋白质分子大小建立的分离纯化方法凝胶过滤（分子排阻层析）常用的凝胶：葡聚糖凝胶琼脂凝胶与琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶分级沉淀（盐或有机溶剂）工艺流程说明：1.发酵液预处理2.压滤3.浓缩4.沉淀5.压滤6.干燥4.4根据蛋白质电荷差异建立的分离纯化方法等电聚焦电泳4.5根据蛋白质吸附特性建立的分离纯化方法4.6根据蛋白质特异亲和力建立的分离纯化方法凯氏定氮法紫外吸收法双缩脲法Folin-酚法（Lowry法，蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸－磷钨酸试剂产生蓝色。）Bradford法（考马斯亮蓝染料结合法）BCA法（bisinchoninicacidmethod）4.7.1．凯氏定氮法4.7.2紫外-分光光度计法4.7.3双缩脲法（Biuret法）4.7.4Folin-酚试剂法（Lowry法）4.7.5考马斯亮蓝G-250染色法（Bradford法）4.7.6．BCA法电泳（等电聚焦、SDS-PAGE、PAGE）沉降法HPLC溶解度分析N－末端分析5.1蛋白质组学的基本概念蛋白质组学研究基本过程是：从细胞、体液或组织中提取蛋白质，经双向电泳技术分离得到蛋白质的表达图谱；采用计算机图像分析技术对图谱上的蛋白质点进行定位、定量、图谱比较、差异点寻找；然后采取两种方法进行蛋白质的鉴定，一是采用蛋白质转膜法进行氨基酸组成和序列分析，再进行数据库搜索比较；二是利用质谱技术进行蛋白质鉴定；最后需要利用生物学或者生物化学方法进行功能的研究和验证。蛋白质组学研究的技术路线5.2.1完整蛋白质分离的方法－凝胶电泳技术2D-SDS-PAGE的分离图谱质谱分析法是通过测定样品中离子的荷质比（m/z）来进行成分和结构分析的方法。生物质谱技术在蛋白质鉴定中起着非常重要的作用。用于蛋白质组学研究的质谱仪有两种类型：MALDI-TOF（基质辅助激光解吸离子化-飞行时间）和ESI（电喷雾离子化）串联MS（质谱）仪器。通过MALDI-TOF质谱仪可以获得肽质量指纹图谱（PMF）。肽质量指纹图谱是指将蛋白质经专一酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱（PMF），是目前蛋白质组学研究中常用的鉴定蛋白质的方法。其基本原理是根据不同蛋白质具有不同的氨基酸序列，经专一酶切位点的蛋白酶水解后会产生序列及大小均不相同的肽片段，这些肽混合物的质量数也具有不同的特征，因此产生肽片段质量图谱，称为指纹图谱。通过数据库中指纹图谱的相似性比较可以进行蛋白质的鉴定，也可以通过这种方法确定2D-SDS-PAGE图谱上的新蛋白。用ESI串联MS分析仪获得的数据则可以弥补一些肽质量指纹图谱中存在的局限，进行蛋白质的鉴定。利用质谱法鉴定蛋白质蛋白质生物信息学的内容包括：序列比对、结构比对、蛋白质结构预测、计算机辅助的基因编码区和非编码区识别、非编码区分析和DNA语言研究、基因表达谱分析、分子进化和比较基因组学、基于结构的药物设计、生物信息处理并行算法的研究、代谢网络分析、基因芯片设计和蛋白质组学数据分析等。1.蛋白质的酸碱性质3.蛋白质分子量大小及测定方法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测相对分子量4.1蛋白质分离纯化的依