分子生物学实验实验一植物基因组DNA的提取及其定性定量分析一、实验目的通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。二、实验原理CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7MNaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。三、实验步骤(一)1.取约100mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mlEP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。2.加入0.6ml2×CTAB提取液(用前加入0.2﹪的巯基乙醇)，混匀，65℃水浴30min，每10min颠倒混匀一次。3.取出离心管，冷却后加入0.6ml酚氯仿混合液，混匀。4.11,500rpm室温离心8min(若没离好可重复一次)。5.将上清液(约400μl)转移到另一新的1.5ml离心管中。6.加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500rpm离心8min，取上清(约350ul)。7.加入600μl无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min。8.4℃，15,800rpm离心20min，弃上清。9.1ml70％乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能Vertex，7,000g离心3min，弃上清，风干。10.加入30μl无菌水(含20μg/mlRNaseA)，37℃溶解DNA30min。11.取5μlDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：(二)制备琼脂糖凝胶称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶中，加入30mL0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。琼脂糖由D-半乳糖和L-半乳糖通过糖苷键交替形成线状聚合物。琼脂糖溶解后链间糖分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，琼脂糖浓度越高，形成的孔隙越小，分辨能力也越强。琼脂糖凝胶的分辨范围一般在0.2-50kb之间。(三)胶板的制备①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具。②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。④室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。⑤加电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1mm。(四)加样在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×。用10μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNAmarker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。上样缓冲液有三个作用：增加样品的密度以保证DNA沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝是带电荷的小分子化合物，呈蓝紫色，是一种凝胶的示踪染料，迁移速率相当于300bp的线性双链DNA分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，可估计样品中DNA分子的迁移位置。(五)电泳①接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm。②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。四、实验结果与分析M4321上样顺序：右一为maker，1、2、3、4为二组成员提取的DNA，条带都较清晰，没有拖带情况，其中第三条带是我提取的DNA，样品研磨充分，所提DNA量大、没有杂质。实验二PCR扩增目的片段一、实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。二、实验原理聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。三、实验步骤1．在200μlPCR管内配制20μl反应体系：反应物体积/μlddH2O11.310×PCR缓冲液2.0dNTP1.6（终浓度20—200μM）引物12.0（引物终浓度0.2μM）引物22.0（引物终浓度0.2μM）模板DNA1.0rTag酶0.1Total202