实验须知1．学生应本着认真、积极的态度，在教师的指导下，完成每次实验。不仅要明白实验的原理、步骤和关键，还要能发现问题，积累经验，并对实验结果进行分析讨论。2．实验课前应当认真预习，并书写简单的预习报告。实验过程中，严格遵守操作规范，实验结果和数据应如实记录，并当堂写出原始实验结果记录，经教师检查同意并签字后，方可离开。实验报告应在实验后一天内完成并交到指定地点。3．遵守课堂纪律，不得迟到早退，实验室内不得吸烟、饮食、大声喧哗，学生之间应互助友爱。4．爱护实验器材。在了解仪器性能和操作规程之前，不得冒然使用，更不可擅自拆卸或将其带出室外。实验过程中，如发现仪器损坏或运转异常，应立即告知指导教师。公用试剂用毕应立即盖好，放回原处，实验中应注意节约。5．注意安全。对腐蚀性试剂或易燃有机溶剂的操作应格外小心；水电煤气在停用时应及时关闭。6．学生应分组轮流值日，负责实验室的卫生和安全。1安全措施1．进入实验室必须穿实验工作服。2．实验室内严禁吸烟，易燃易爆物品应远离火源。低沸点的有机溶剂，不得在火焰上直接加热；必须加热时，可在水浴进行。3．使用电器设备要严防触电。切忌用湿手触摸电器。发现仪器漏电时，立即报告并停止使用。万一发生触电事故，应立即关闭电源，并用干木棍将导线挑离被电者身体；对呼吸停止者，应立即进行人工呼吸，并及时送医院抢救。4．强酸、强碱液体或剧毒液体，不得用口经吸量管吸取，必须使用橡皮球，万一不慎吸入口内或沾及皮肤，应立即用清水多次漱口或局部冲洗。若为强碱灼伤，清洗后可用5％硼酸溶液清洗；若为强酸灼伤，水洗后可用5％碳酸氢钠溶液清洗。严重灼伤者，应立即将残留在身体上的液体轻轻冲洗后，送医务部门处理。5．用后的浓酸、浓碱残液，应倒入指定的容器。不要直接倒入水池内，以免蚀损水管；若少量残液已倒入池内，应立即放水冲稀流走。6．万一着火，不要惊惶失措，要立即切断火源和电源，搬走易燃物品，同时立即报告指导老师进行紧急处理，严防火势蔓延；若火势蔓延，应立即报警。7．分子生物学实验废弃物的处理溴化乙锭（EB）：溴化乙锭是强诱变物，并有中度毒性。使用时应戴一次性手套，实验操作宜固定在一定的区间、使用相对固定的容器。实验结束后，在教师的指导下统一进行回收处理。细菌培养物：细菌培养物及所接触的平皿应在121℃、30min消毒后方可丢弃。2实验一质粒DNA的提取纯化、限制性酶切及电泳检测内容提要本实验采用碱裂解法提取细菌细胞中的质粒DNA，经酚/氯仿/异戊醇抽提和乙醇沉淀等步骤，从而得到适用于基因操作的质粒DNA。采用分子生物学软件查找质粒DNA的酶切位点，然后利用限制性内切酶对质粒DNA进行酶切反应，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离和凝胶成像系统进行分析鉴定。本实验要求：1．通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNA。2．掌握质粒DNA的限制性内切酶酶切分析，了解内切酶的性质。3．学习DNA的电泳检测。原理1．质粒DNA的提取把一个目的DNA片段通过重组DNA技术，进入受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。质粒(Plasmid)作为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，广泛应用于基因操作的各个方面。因此，质粒的分离与提取是分子生物学中最常用、最基本的实验技术。质粒是一种染色体外的DNA分子，其大小范围从1-200kb不等。大多数来自细菌细胞的质粒为双链、共价闭合环状的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型和松驰控制型。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。通常所用的质粒载体有pBR322、pUC18、pUC19等，本实验提取pUC19质粒。3从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。碱裂解法的原理是：碱性条件下，用十二烷基磺酸钠(SDS)破坏菌体细胞壁，并使菌体蛋白质和染色体DNA变性，双链解开。质粒DNA具超螺旋闭合环状结构，虽变性但两条互补链不会完全分离。当pH被调至中性后，质粒DNA可以恢复构型，并以溶解状态存在