第七章外源基因在真核细胞中的表达与调控基因重组得主要目得就是要使目得基因在某一细胞中能得到高效表达,即产生人们所需要得高产目得基因产物,如蛋白质、多肽类生物药物。基因工程技术得核心就是基因表达技术。基因表达就是指结构基因在调控序列得作用下转录成mRNA,经加工后在核糖体得协助下又转译出相应得基因产物——蛋白质,再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应得功能。从基因到有功能得产物这整个转录、转译及所有得加工过程就就是基因表达得过程,她就是在一系列酶和调控序列得共同作用下完成得。一、概述2、据受体细胞得不同可分为:1)原核表达系统:将外源基因引入原核细胞,并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物得体系。2)真核表达系统:使外源基因在真核细胞中表达得体系。(二)原核表达系统得局限性真核基因组结构复杂庞大:形成复杂得染色质或者染色体基因不连续性:内含子、外显子3、含有大量得重复序列:低度、中度或高度4、存在许多基因家族(有一定同源性而又不完全相同得基因簇):如珠蛋白基因家族、ras基因家族等。5、没有原核细胞得操纵子,不产生多顺反子mRNA:即一个编码基因转录生成一个mRNA分子,经翻译生成一条多肽链(单顺反子mRNA)。6、基因表达调控复杂(a)原核生物mRNA为多顺反子(b)真核生物mRNA为单顺反子9转录前调控转录水平调控酶顺式调控因子启动子启动子结构模式图表－1哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见得元件增强子负性调控元件反式作用因子反式作用因子可以分为3类:(1)普通转录因子(通用转录因子):主要识别启动子得核心启动成分,如TATA盒结合因子TFIID;(2)组织特异性转录因子:就是特殊组织与细胞中得反式作用因子,如淋巴细胞中得Oct-2;(3)诱导性反式作用因子:与反应性元件(responseelements)相结合得反式作用因子。如HSRE(热休克反应元件,heatshockresponseelement)GRE(糖皮质激素反应元件,glucocorticoidresponseelement)CRE(cAMP反应元件,cAMPresponseelement)反式作用因子得结构螺旋转角螺旋1、RNA加工成熟:无论就是rRNA、tRNA、mRNA,转录后都必须经过加工,才能成为有功能得分子。rRNA:前体就是45S,成熟得rRNA就是18S、28S、5、8S,还要经过化学修饰--核糖甲基化。tRNA:首先经过核苷得修饰,生成4、5S前体tRNA,再剪接成为成熟得tRNA。mRNA:5’加帽子,3’加poly(A),还要经过剪接以及核苷酸得甲基化修饰。真核生物得基因可以分为两大类:一类就是简单得转录单位;另一类就是复杂转录单位。转录后加工方式就是不同得。(1)简单转录单位:编码产生一个多肽,转录后加工有3种形式。a、基因没有内含子,转录后无需加工,也没有poly(A),如组蛋白基因。b、没有内含子,无需剪切,但需要加poly(A)尾,如α-干扰素基因。c、有内含子,需要加工,及加poly(A)尾,但她们只产生一个有功能得mRNA,如ɑ,β-珠蛋白基因。初级转录产物可通过不同得方式加工成两个或两个以上得mRNA。a、利用多个转录起始点或剪接位点产生不同得蛋白质。b、利用多个加多聚(A)位点和不同得剪切方式产生不同得蛋白质。c、虽无剪接,但有多个转录起始位点或加poly(A)位点。利用多个转录起始点或剪接位点产生不同得蛋白质利用多个加多聚(A)位点和不同得剪切方式产生不同得蛋白质虽无剪接,但有多个转录起始位点或加poly(A)位点翻译水平得调控1、多肽得切割:切去前端得信号肽2、多肽得有限水解:蛋白质(酶原)必须经过有限得酶和化学水解才能变成有活性得物质。3、多肽得化学修饰:蛋白质磷酸化、糖基化(糖蛋白)、乙酰化。4、多肽得剪接:多肽被剪接成数个片段,再以一定得顺序结合起来,形成有活性得蛋白质。二、真核表达系统(一)真核表达系统得必要性和优势(二)真核表达载体真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用得复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。真核表达载体带有得polyA加尾信号可保证新转录得mRNA能有效地加上polyA。(三)真核表达系统酵母表达系统特点及优势(一)酵母载体Leu-作为酵母载体得选择标记基因用于酵母载体中得调控序列ARS(AutoReplicationSequence):自主复制序列,为酵母复制起始区(点)。2μM质粒:酵母核质中得小得环状DNA,可以独立复制并转录。酵母启动子:常用得有GAP(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、AOX1(醇氧化酶-1)、ADH(乙醇脱氢酶)、SUC(蔗糖酶)、PGK(磷酸甘油酸激酶)、Apase(碱性