一.实验目的二.实验原理SDS的作用当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：LgMW=－bmR+K其中，MW为蛋白质的分子量，mR为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳Gel将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量操作过程3.按比例配好分离胶,用移液管快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶凝*凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡*水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入梳子,静置到胶凝*梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出6.上样：（1）marker5µl（2）细胞样品10µl+2×上样buffer10µl共20µl100℃沸水浴，3-5min？（蛋白变性）7.微量注射器（加样器）上样,上样量15µl*微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA（120V），当进入分离胶后改为20mA（180V），溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色1小时左右10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰*剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分11.实验结果分析按下式计算相对迁移率：每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性注意的问题？浓缩胶的作用常见问题及解决办法4.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致5.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片得凝胶聚和不完全6.凝胶时间不对。通常胶在30min-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂试剂配制（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml（13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml影响因素