第十二章植物遗传转化植物遗传转化(plantgenetictransformation)是指通过某种途径将外源基因导入受体植物基因组中，并使之在受体植物细胞内实现功能表达。这个被导入的外源基因称为转基因(transgene)，所得到的植株称为转基因植物(transgenicplant)。植物遗传转化是植物基因工程的主要内容。通过基因转移技术可以把不同来源的基因包括来自异种植物、动物和微生物的基因导入植物细胞，这种大范围的基因交流为创造有价值的植物新种质材料，并培育新品种奠定了基础。第一节植物基因工程载体及其构建一、植物基因工程载体种类按功能及构建过程，又可把有关载体分为四大类型克隆载体：用于保存和克隆目的基因。中间载体：包括中间克隆载体和中间表达载体，前者是由大肠杆菌质粒插入了T-DNA片段及目的基因、标记基因等构建而成，是构建中间表达载体的基础质粒。后者是含有植物特异启动子的中间载体，其功能是作为构建转化载体的质粒。卸甲载体：卸甲载体是解除武装的Ti质粒或Ri质粒，其功能是作为构建转化载体的受体质粒。转化载体：是用于目的基因导入细胞的载体，亦称工程载体。它是由中间表达载体和卸甲载体构建而成的，根据它的结构特点又可分为两种转化载体，即一元载体系统和双元载体系统。二、根癌农杆菌Ti质粒的结构与功能冠瘿瘤病(根癌病)症状1、植物根及茎基部产生2、最初原因是受伤后引起发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenesis)1、Ti质粒的遗传特性及类型2、Ti质粒的基因位点及其功能区域三、Ti质粒介导基因转化的原理土壤农杆菌与植物细胞相互作用的可能性机制四、Ti质粒的改造与载体构建1、天然Ti质粒的缺点Ti质粒虽然是一种有效的天然载体，但并不能直接用作克隆和转化外源基因的载体，其原因如下：①T-DNA区内存在不利于植物遗传转化的基因：T-DNA区内含有许多编码基因，其中onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，使转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株再生。另外，冠瘿碱的合成会造成能量物质的浪费。②Ti质粒分子量过大(一般160～240kb，有的甚至达800kb)，在基因工程中难以操作。所以要切去一切不必要的大片段DNA。③大型Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，不论用何种限制酶切割，都会切成很多片段，难以找到可利用的单一限制内切酶位点，因而不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因。④Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。⑤Ti质粒在大肠杆菌中不能复制，Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增，而农杆菌的接合转化率极低。因此，必须对野生型Ti质粒进行改造，去掉无用或不利的部分，加上必需的部分。下面介绍基因工程对Ti质粒的改造要求：2、载体Ti质粒应具备的结构①选择标记基因。如新霉素磷酸转移酶基因，它能使转化的植物细胞获得对卡那霉素的抗性。②DNA复制起始位点。它使Ti质粒能在大肠杆菌中复制（用于克隆），而植物转化载体还同时带有可在土壤根癌农杆菌中进行复制的复制起始位点（用于转化）。③T-DNA右边缘序列。它对于T-DNA的整合必不可少。目前使用的大多数克隆载体都含有两端的边缘序列。④多克隆位点。为能方便克隆基因，人们在载体的左右T-DNA边缘序列之间设计了一段DNA序列，包含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点。3、中间载体的构建为解决Ti质粒不能直接导入目的基因的困难，需要构建中间载体(含有多种限制性酶的多个切点)。中间载体是一种在一个普通大肠杆菌的克隆载体（例如pBR322质粒）中插入了一段合适的T-DNA片段而构成的小型质粒。中间载体通常是多拷贝的E.Coli小质粒，这一点对于体外遗传操作是非常必要的。载体从功能上可分为两大类:克隆载体和表达载体。克隆载体的主要功能是复制和扩增基因，而表达载体是适于在受体细胞中表达外源基因的载体。中间载体中插入的外源基因能否得到表达，又是一个十分重要的问题，如果不在结构基因之前加上适宜的启动子，则该基因就不能在植物中表达。因此，完整的（中间）表达载体应包括如下的结构：“植物特异性启动子+目的基因+终止子”、“植物特异性启动子+选择标记基因+终止子”和“植物特异性启动子+报告基因+终止子”，即是一种嵌合基因。3、植物基因转化载体系统的构建共整合载体系统的构建双元载体系统五、载体构建中常用的选择标记及报告基因如何选择和筛选转化体，同样是一个重要的问题。科学家们一直试图在转化体带上一个标记，从而便于选择和筛选。选择标记基因和筛选标记基因（又称报告基因）在功能和性质上有一定的差异。选择标记基因是：该基因的产物赋予植物细胞某种抵抗