免疫实验—抗血清制备及抗体效价检测摘要：用具有抗原性的物质牛血清白蛋白（BSA)注入到健康动物例如鼠、兔的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。抗血清，是指含有免疫蛋白的血清。抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。此次实验主要是进行小鼠的牛血清白蛋白（BSA)抗血清的制备过程，并通过酶免疫吸附试验（ELISA）对其进行抗体效价检测。关键字：牛血清白蛋白（BSA)抗血清抗体效价免疫实验过程：本次实验一共分为三个分实验：实验一：免疫实验二：抽血、放血，分离抗血清实验三：ELISA测定抗体效价实验一：免疫一、抗血清制备的原理用具有抗原性的物质注入到健康动物的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。抗体主要存在于血清中，经多次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。二、目的制备高效价的抗血清三、实验仪器、材料和试剂实验仪器：1mL注射器，酒精棉球，剪刀材料：家兔，小鼠试剂：3％～5％苦味酸溶液或80％～90％苦味酸，牛血清白蛋白（BSA)三、方法和步骤1、动物编号左前腿上部为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右侧从前至后依次为7、8、9。红色表示十位数,用黄色表示个位数。免疫前用金属编号牌固定兔耳，或用染料涂沫在动物的背部，作出明确的标记。2、动物抓取及注射按如下图所示抓取目标动物家兔为300～600μg/次（400），每次不超过2mL；小鼠为10～100μg/次（10-20，20~40μg/ml），每次不超过0.5mL。小鼠腹腔注射以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推?0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。兔子可以分别尝试皮下（脚掌）、皮内、耳静脉、肌肉注射实验二：抽血、放血，分离抗血清一、采血小鼠采血（一）、尾部采血：需血量少时可用此方法。将小鼠放在在有开孔的离心管内，显露尾部，将尾端剪去约5mm，从尾根部向尾端部按摩，血即从断端流出。（二）、小鼠睚眦采血：将毛细管折断，使其断口锋利。采血时，左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并用中指配合，轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛充血。用毛细管的断口，右手拇指、食指和中指握住毛细管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入约2~3mm，手指旋转捻动毛细管以刺破静脉丛，鼠血顺毛细管流入1.5mL无菌离心管中，收集鼠血。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法短期内可重复采血。小鼠一次可采血0.2—0.3ml，大鼠一次可采0.5—0.1ml。家兔的采血（一）、耳静脉抽血：将家兔置于兔固定箱内，对家兔进行耳静脉抽血，此法用于小量抽血，验血测抗体效价，以便决定加强免疫或放血，与耳静脉注射方式相反。（二）、心脏抽血：家兔固定（仰卧）---准确找到心脏部位---剪毛（心脏部位）---消毒---进针（50ml注射器接带硅胶管的12号针头）抽血，抽至50ml，从硅胶管接头处取下注射器，拔针头，将血液注入100ml无菌空三角瓶，再重复上述操作继续抽血，直至抽完。（三）、颈动脉放血：家兔固定（仰卧，身体及头部固定）---剪毛（颈部）---找颈动脉管（消毒---剖开颈部；开皮、膜、肌肉，找到气管两边的颈动脉管（桃红色，有脉动））---小心分开动脉上的肌肉、神经（2条，白色）等---开口（见图）---放血，接入100ml无菌空三角瓶。注意：看到气管，停用所有锐器，可用止血钳、钝玻棒。注意不要剪破毛细动脉管！！！二、抗血清的分离，保存1、斜置装血液的三角瓶0.5-1h；2、用无菌玻棒剥落、松动瓶壁上的血块（利于血清析出）；3、原样包扎好，做好记号，放进冰箱（4℃）过夜；4、次日：估计分离的血清量并观察描述血清颜色；去血块，离心取上清（3000rpm,20min），加叠氮钠（终浓度为0.1%），混匀，分装小管，作好标记，-20或-80℃保存待测。实验三：酶免疫吸附试验法（ELISA）测定抗体效价一、ELISA原理酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，简称ELISA)是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。ELISA过程包括抗原(抗体)包被在固相载体上，