抗多肽制备流程及原理1、抗原多肽得设计(3)抗原性与免疫原性单独得抗原决定簇就是不能产生免疫反应,她只有抗原性但没有免疫原性,为使她能具有免疫原性,她必须偶联在载体蛋白上。(4)抗原决定簇得预测对每个氨基酸得表面可接触性、亲水性和弹性进行计算可以大体推算出抗原决定簇区域,抗原决定簇区域应综合以上三个特点。目前市面上有几个专业测定软件满足需要:如MacVestor,Protean,GCG等。(5)设计多肽序列得长度另一方面,太短得多肽(<10个氨基酸)则会产生识别特异性很强得抗体,以至于无法识别整体蛋白,或亲和性很低。因此综合考虑制备性抗原地多肽有效长度一般就是10－20个氨基。这种长度得多肽序列会最大程度得减小生化合成困难,具有一定得水溶性,也会具有一定程度得二级结构。(6)设计合成多肽一旦抗原序列决定后,接下来就就是设计所需合成得多肽了,设计时除了注意其序列外,同时应考虑一些产生免疫机制问题,如:1、载体蛋白得接入位置。2、抗原多肽得耦联策略设计合成性多肽常常被忽略得一个方面就是如何将多肽耦联到载体蛋白上。例如,N-端序列需要通过C-端氨基酸耦联,而C-端序列则需要通过N-端氨基酸耦联。内部序列则可以耦联到任何一端。内部序列耦联得另一考量则就是将非共轭端酰基化或氨基化,因为原蛋白分子序列中不会含有带电荷得末端。最常用得耦联方法都就是基于自由氨基(alph-氨基或Lys)、sufhydryl(Cys)或羧基集团(Asp,Glu,或alpha-羧基)得存在。所有得耦联方法都应该就是通过羧基或氨基端残基将多肽耦联到载体蛋白上。所选序列不能有多个残基都能参与所选耦联化学反应。如果多个反应位点存在,可以考虑将多肽序列缩短,或者选择所有反应位点都位于一端得多肽。对于内部序列通常会使用离所预测抗原位点较远得一端进行耦联,这样可以避免可能得屏蔽问题。除非研究人员另做说明,我们通常使用EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)或carbodiimide方法将多肽和载体进行耦联。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸得侧链羧基集团及末端羧基集团,使之与主胺基发生耦联反应。激活得多肽与载体蛋白混合而产生最终得共轭体。如果载体蛋白先被激活,EDC方法则通过N-末端alpha-氨基,或者,如果序列中有赖氨酸得话,则可以通过赖氨酸得侧链氨基与载体蛋白耦联。m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide酯(MBS)就是一种双性多肽耦联试剂,可以将多肽与载体蛋白通过半胱氨酸耦联。耦联发生在半胱氨酸得硫醇基。大家有疑问的，可以询问和交流因为与牛血清白蛋白(BSA)耦联得多肽刺激产生得抗血清也含有针对BSA得抗体,一次可能导致假阳性结果。尽管KLH较大并有抗原性,但她在耦联过程中可能会沉淀,因而有时候会很难处理。卵清蛋白(OVA)就是另一种可以使用得载体蛋白。当要检验抗体只就是针对多肽而不就是针对载体蛋白时,OVA时用作第二载体得很好选择。当要将抗体抗载体蛋白得反应降到最低时,可以使用兔血清白蛋白做载体。3、多肽合成原理3、2多肽合成原理3、4羧基保护3、5侧链功能团得保护3、6肽键生成得方法羧基取代基得活化能力顺序3、7肽键生成得方法2、混合酸酐法:反应一般分两部进行歧化反应和酸酐分解:二酰胺得形成:羧酸酯氨解生成酰胺得反应就是胺对酯进行亲核取代,因此增加R‘基团得吸电子能力必将增加羰基碳原子得正电性而有利于氨解反应得进行。活化酯得种类:1)芳基活化酯2)烯基酯3)与N-羟基化合物形成得活化酯4)活化酰胺5)固相活化酯活化酯得制备:1)DCC法2)转酯反应3)加成4)混合酸酐法4、NCA法NCA得合成:酰氯法、光气法3、8固相合成固相合成流程示意:氨基酸在进入目得肽之前,氨基端需要保护基。根据保护基得不同,多肽固相合成方法可以分为两大类:Boc方法和Fmoc方法。4、2动物免疫4、3抗多肽血清得制备(SOP)序号(1)收集血样(如从耳动脉或耳静脉),每只家兔准备2～5ml免疫前得血清。(由于本实验室已经储备家兔免疫前血清,本步骤可以省略)。(2)按表1中免疫程序进行免疫。a)将0、7～1、0mg得肽一载体得连接体溶于1ml得PBS,并加入1mlFCA彻底混溶。每只家兔免疫接种1ml这种稳定得乳浊液,在皮下多个位点接种,每个位点0、1～0、2ml。b)2～6周后(或检测到免疫反应减弱时较理想;准备一份新得乳浊制剂追加剂量,使用相同得连接体但添加得就是弗氏不完全佐剂。如上所述在皮下多个位点接种。若免疫原得量有限,则使用初次免疫接种量得1/4。注意加强免疫时注意家兔皮肤溃疡情况,如有