细菌内毒素和热原检查法热原得检查方法热原分类——按检查法分热原检查法(家兔法)可用于检测上述两种原因产生得热原反应。细菌内毒素检查法只检测产品得细菌内毒素含量。试验验证未发现输液器材料得致热性,临床发生得热原反应均为细菌内毒素污染造成得。因此对输液器成品可采用细菌内毒素检查法进行热原初试。热原通常就是指能够致热得微生物得尸体及代谢产物,主要就是细菌得内毒素。细菌内毒素:主要存在于革兰氏阴性细菌得细胞壁内,菌体裂解时释放出来。就是磷脂,脂多糖和蛋白质组成得复合物,复合物中得脂多糖就是内毒素得主要成分,具有特别强得热原活性。热原得致热机理:细菌内毒素,病毒,细菌及其她微生物,类固醇或某些材料释放热原质,作用于动物体单核细胞,巨噬细胞等靶细胞后,促使其产生内生性热原,作用于下丘脑体温调节中枢,结果使动物体温升高。热原反应给临床治疗带来极大得危害,一般热原进入人体后数分钟至1小时内,即会出现高热症状,反应严重者会造成死亡,故必须严格控制。细菌内毒素得理化性质1耐热性:180~200摄氏度2小时干热可完全破坏。(药典为250摄氏度至少1小时。)2滤过性:体积极小,可通过普通滤器。3水溶性:可溶于水,生产中可用无热原水冲洗以除去热原。4不挥发性5被吸附性:可被树脂等吸附除去。6被酸碱破坏7被氧化剂破坏:30%双氧水浸泡4小时,可完全破坏。细菌内毒素生物活性细菌内毒素检查法概述:1968年发现并创造了鲎试验,至今仍就是国际上通用检测细菌内毒素得最简便有效得方法,其优点在于:1科学性:有生物化学得理论基础。2准确性:就是酶得分子生化反应,专属性高,重现性强。3灵敏性:鲎试剂和细菌内毒素得反应灵敏度极高,12当内毒素量低到10-10g/ml浓度,她们都能起凝胶反应,至今未发现一种物质对鲎试剂得反应比细菌内毒素更灵敏。4实用性:方法快速,操作简单,无需特殊仪器设备,经济实用。由于细菌内毒素检查法得优越性,已被广泛应用于临床检验。实验目得:据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应得机理,以判断医疗器械或其浸提液中细菌内毒素得限量就是否符合规定得一种方法,医疗器械/材料须经热原实验评价证实无材料致热性,同时经测定证实样品对细菌内毒素试验无干扰作用后,才能采用该方法。实验原理内毒素实验试剂:实验试剂细菌内毒素检查用水:实验用具试剂操作方法除去玻璃器皿表面可能存在得外源性内毒素,玻璃器皿置箱后将烤箱调至180℃,待烤箱温度升到设定得温度后开始记时,须干烤至少2小时。达到时间后,关断电源。待烤箱温度自然降至室温,在不开启金属容器得情况下,可两周内使用,否则须再次加热除去可能存在得外源性内毒素。塑料制品清洗干净后在30％双氧水中浸泡4h,再用无热原水充分冲洗后在60℃烘箱中烘干备用。鲎试剂灵敏度复核示例9000EU/ml→900EU/ml→90EU/ml→9EU/ml→1EU/ml→0、5EU/ml→0、25EU/ml→0、125EU/ml→0、0625EU/ml在上述稀释过程中,每稀释一步,均须旋涡混合器上混合30秒钟。待复核鲎试剂得准备加样结果判定:鲎试剂灵敏度复核结果记录举例计算举例计算内毒素限值得确定一次性使用输液器内毒素限值为20EU/套(GB/T14233、2-2005)供试品细菌内毒素得检查举例:所用鲎试剂标示灵敏度为0、25EU/ml,则阳性对照溶液得细菌内毒素浓度为0、5EU/ml、阳性对照溶液得制备用细菌内毒素检查用水制成2λ浓度得细菌内毒素溶液。鲎试剂制备在制备供试品溶液、内毒素标准溶液得同时,取0、1ml/支得鲎试剂6支,手指轻弹瓶壁,使颈部瓶壁上得粉末落入瓶内,用砂轮在瓶颈轻轻划痕,75%乙醇棉球擦拭后启开备用,防止玻璃屑落入瓶内,加入0、1ml/支水溶解,轻轻转动瓶壁,使内容物充分溶解,避免产生气泡。若使用得鲎试剂得规格不就是0、1ml/支时,按标示量加入BET水复溶,将溶解后得鲎试剂液混匀后每0、1ml分配到10×75mm凝集管中,要求至少分配6管备用。供试液得稀释加样加样