会计学实验安排碱性(jiǎnxìnɡ)磷酸酶的定点突变反应体系(tǐxì)ddH2OXuL2.5mmol/LdNTP4uL10xbufferMg2+Free5uL引物（10umol/L）2uL/each模板DNA1uLEx－TaqE0.3uL（1.5U）PCR产物的回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒）1.切胶、称胶重,每100mg胶加入700uL溶胶(róngjiāo)液，550C溶胶(róngjiāo)(一定要完全溶解)。2.装柱，12000rpm离心30秒，去除废液。3.漂洗:500uL漂洗液，12000rpm,30秒漂洗一次，去除废液,重复漂洗一次。4.12000rpm,2分钟，换成干净的无菌1.5mL小管。5.向柱子的正中央加20uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。6.12000rpm,30秒。7.向柱子的正中央加10uL洗脱buffer或无菌水，放置5分钟。8.12000rpm,2分钟。9.SYBR检测回收产物质粒DNA的提取接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mLLB羧苄（50ug/mL）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜4000rpm、离心1min，收集所有菌体150uL溶液(róngyè)I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min加入200uL溶液(róngyè)II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清加入200uL溶液III（轻轻混匀!），冰上静置15min质粒DNA复性(fùxìnɡ)12000rpm，离心10min上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min上清加等体积的氯仿：异戊醇（旋涡混匀）12000rpm，离心5min上清加2倍体积的无水乙醇(yǐchún)（旋涡混匀），室温30min12000rpm，离心10min沉淀用75%乙醇(yǐchún)1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心5min沉淀于超净台中风干沉淀加入20uLRTE，600C水浴30分钟溶解-200C保存370C酶解3小时酶切产物的纯化和回收(博大PCR产物快速胶回收试剂盒）每100uL溶液加入700uL溶胶(róngjiāo)液，其余的操作步骤同前。向柱子的正中央加20uL洗脱buffer，其余的操作步骤同前。连接反应体系（20uL）感受态细胞的制备1.预培养：接DE3PlacI单菌落(jūnluò)到含34ug/mLCam的3mLLB培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜2.取0.4mL预培养菌液转移到含34ug/mLCam的40mLLB液体培养基的锥形瓶中，370C、250rpm振荡培养2.5-3小时（OD6000.4-0.5）3.将菌液转移到50mL离心管中，冰上放置10min4.40C，4000rpm，离心10min5.到出培养液，将管倒置使培养液流尽6.菌体加入预冷的0.1mol/L的CaCl210mL，用5mL枪头轻轻吹散菌体细胞，冰浴30min7.40C，4000rpm，离心5min，去上清8.用冰预冷的0.1mol/L的CaCl22mL用枪轻吹悬浮(xuánfú)细胞，冰上操作9.分装细胞200uL/份，此为感受态细胞（也可于-700C或-200C冻存）取200uL感受态细胞，加入连接产物10uL取200uL感受态细胞，加入质粒DNA2uL（5－50ng)（阳性对照）取200uL感受态细胞，加入2uL无菌水（阴性对照）取200uL0.1mol/L的CaCl2，加入连接产物2uL（阴性对照）用枪头混匀，冰上放置30min2.420C水浴热激90秒3.冰浴2分钟复苏每管加800uLLB液体培养基，370C慢摇1小时（150rpm）选择性筛选将复苏菌液4000r/min离心1min，先吸去900uL上清，再将细胞吹散成细胞悬液，取50uL细胞悬液直接涂布在选择平板(píngbǎn)(50ug/mLCarb,34ug/mLCam,40ug/mLBCIP)上，倒置培养过夜（370C）表达(biǎodá)与活性检测单克隆抗体(kàngtǐ)动物(dòngwù)免疫1.包被特异性抗原：将BSA用包被液稀释至2ug/ml，每孔加入100ul，37℃2小时；2.封闭：弃包被液，每孔加入200ul封闭液，37℃孵育1小时；3.加一抗：弃封闭液，甩干，每孔加入一抗(,PBS稀释液、阴性血清、小鼠抗血清1:500,1000,2000,4000,8000,16000)100ul，37℃孵育2小时；4.洗涤:弃一抗，甩干，手工(shǒugōng)洗涤，洗三次，甩