课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段课标领航1．尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作。2．理解PCR的原理和反应过程。3．讨论PCR的应用。【重点】PCR的原理和反应过程。【难点】PCR技术的操作过程。情境导引PCR诊断技术又叫多聚酶,链式反应技术，它采用分子技术,模拟核酸在体内的复制，从而判,定疾病病原体的种类，所以从本,质上来说，这是一种分子诊断方法。基础自主梳理(2)子链的合成：①需要______；②合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。3．条件(1)______模板。(2)分别与模板DNA两条链相结合的两种引物。(3)A、T、G、C四种______________。(4)耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶。(5)需要稳定的_____和能严格控制_____的温控设备.思考感悟1．什么是引物？若要克隆DNA，应加入几种特定的引物？【提示】所谓引物是指两段与待扩增的DNA序列互补的一小段DNA或RNA片段。DNA是由两条反向平行排列的脱氧核苷酸长链构成的。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此克隆DNA时应加入两种引物。二、PCR反应过程PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为____、复性和延伸三步。1．变性：当温度上升到______以上时，双链DNA解聚为单链。2．复性：温度下降到_______左右，两种引物通过________________与两条单链DNA结合。3．延伸：温度上升到_____左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在_______________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。思考感悟2．PCR循环过程中，变性温度设置95℃，时间设置30s的原因是什么？【提示】变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增。变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。大家有疑问的，可以询问和交流三、实验操作1．实验用具(1)PCR仪：该仪器能自动调控_____，实现DNA的扩增。如果没有PCR仪，可用3个___________代替，操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管。(2)微量离心管：总容积为0.5mL，实际上是进行离心的场所。(3)微量移液器：用于吸取转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头每吸取一种试剂后都要更换。2．操作步骤准备→____→混合→_____→反应。四、操作提示1．为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行__________。2．所用的_________和酶应分装成小份，并在－20℃储存。五、DNA含量的测定1．原理：利用DNA在260nm的紫外线波段的______曲线来测定相应含量。2．计算公式：DNA含量(μg)＝50×(260nm的读数)×_____________。核心要点突破2．PCR原理——DNA的热变性原理通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动控制温度的仪器。3．生物体内DNA复制与PCR反应的区别(2011年聊城高二检测)下列关于DNA复制和PCR的描述中，正确的是()A．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链B．DNA复制不需要引物C．引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D．PCR扩增的对象是氨基酸序列【尝试解答】__C__【解析】由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，故DNA复制需要引物，而且它与DNA母链通过碱基互补配对结合。PCR扩增的对象是DNA，而不是氨基酸。【探规寻律】(1)引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。包括引物Ⅰ和引物Ⅱ两种。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。(2)细胞内DNA复制与PCR技术的原理和过程容易发生混淆，特别应注意区分PCR反应需要可变的温度，而体内DNA复制需要稳定的温度。跟踪训练(2011年海淀区高二检测)关于DNA片段PCR扩增实验的描述中不正确的是()A．加入的TaqDNA聚合酶耐高温B．不同大小DNA在电场中迁移速率不同C．此过程需要DNA连接酶D．扩增区域由两种引物来决定解析：选C。PCR扩增实验是在较高温度下进行的，故需要耐高温的TaqDNA聚合酶，但不需要DNA连接酶，A项正确，C项错误。因为不同大小的DNA带有不同数量的电荷，所以在电场中迁移速率不同，B项正确。PCR扩增需要两种引物，分别与DNA的两条模板链互补，则D项正确。要点二2.实验用具(1)PCR仪：PCR自动化程度较高，参照下表设计程序即可。若无PCR仪，可用恒温水浴锅代替