第9卷第4期2010年8月广州大学学报(自然科学版)JournalofGuangzhouUniversity(NaturalScienceEdition)Vo.l9No4.Aug.2010文章编号:16714229(2010)04003704拟南芥AtJ2基因植物超量表达载体的构建杨礼香,王正询,柯德森,巫锦雄,黎钰汝(广州大学生命科学学院,广东广州摘510006)要:在胁迫条件下,分子伴侣可以稳定蛋白质结构,防止蛋白质凝聚变性,并修复受伤害蛋白.J蛋白是一类*重要的分子伴侣.AtJ2是拟南芥(Arabidopsisthaliana)J蛋白中的一种.为研究该基因的功能,提取了拟南芥幼苗的总RNA,经过RTPCR获得了AtJ2的全长.并将其构建入表达载体pMD中,得到重组质粒pD/AtJ2通过农杆M.菌(Agrobacteriumtumefaciens)将此重组质粒转化入拟南芥,得到了转基因植株,为后续该基因的功能研究奠定基础.关键词:转基因;拟南芥;AtJ2中图分类号:Q942文献标志码:A分子伴侣,参与底物多肽的正确折叠、组装、转运等,对维持细胞内蛋白的内稳态非常重要.热休克蛋白70(Hsp70s)和相应的J蛋白共同组成分子伴侣机器,其中J蛋白的作用是作为HSP70的同[2]伴蛋白刺激HSP70的ATP酶活性和催化活性.J蛋白也称为Hsp40s或DnaJ到目前为止,报道拟.南芥(Arabidopsisthaliana)中的J蛋白共有120种,其中116种具有典型的J蛋白结构,4种有类似J蛋[3]白的结构.根据这些蛋白的结构不同,将它们分为4类.第1类含有DnaJ蛋白所有的结构域(J结构域,G/F结构域,锌指结构域,C端结构域),第2类缺少锌指结构域,第3类指含有J结构域,第4类是一类与J蛋白在重要序列和结构上都类似但缺少HPD结构的蛋白.除了在维持细胞内蛋白的内稳态中起重要作用外,拟南芥J蛋白的功能还涉及到膜蛋白的降解、线粒体的产生、配子体[3]的形成、花粉的萌发以及信号转导等许多方面.AtJ2是最早从拟南芥中发现的J蛋白之一,包含典型的J蛋白特征结构域:J结构域、/F结G构域和锌指结构域,C端还有一个法尼基化信号(CAAQ).纯化的重组AtJ2能刺激玉米HSP70的ATP酶活性提高10倍,这表明它具有同伴蛋白的功能.AtJ2在植物的根、叶、茎、花和角果中都有表达,并在植物整个生长周期中都有表达.研究表明,37热激、冷处理、水分胁迫都能提高拟南芥叶中AtJ2基因的表达水平,因此AtJ2可能参与多收稿日期:2009-12-18;修回日期:2010-03-24[7][6][4-5][1]种环境刺激的响应,其功能可能与多种胁迫的抗性相关.为进一步研究该基因的功能,本研究从拟南芥中克隆了拟南芥AtJ2基因,并将其构建到植物超量表达载体中,转化了拟南芥,为进一步对该基因的功能研究奠定基础.[8]1材料与方法11材料.E.coliDH5、3101菌株,pGVMD质粒,Columbia生态型拟南芥(ArabidopsisthalianaCol0)种子为本实验室保存.总RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒等购自上海生工,RTPCR试剂盒、MD18T、p限制性内切酶、连接酶、DNA分子质量标准等购自大连宝生物公司,其它化学试剂为国产分析纯.12总RNA的提取.取4~5叶龄期幼苗叶片,按照总RNA提取试剂盒的操作说明书进行,提取拟南芥幼苗的总RNA.13AtJ2基因的扩增.根据GenBank的AtJ2基因序列(At5G22060),设计和合成引入限制性内切酶位点的引物AtJ2F(5CGGGATCCAAGTTAGCAGCCACAACA3)和AtJ2R(5CGGGATCCAGGAGAAAAGACAGAAGC3).以前面提取的拟南芥幼苗的总RNA为模板,以AtJ2F和AtJ2R为引物,通过RTPCR(参照试剂基金项目:广东省自然科学基金项目(8451009101001243);广州市属高校科技计划项目(08C029)资助作者简介:杨礼香(1972-),女,讲师,博士.Emai:yanglx@gzhu.educnl.*通讯作者.Emai:wangzhengxun@163coml.38广州大学学报(自然科学版)第9卷盒说明)扩增AtJ2全长基因.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测并纯化后,与pD18T过夜连接,再M转化进DH5.取筛选的阳性克隆送交上海生物工程公司测序.14表达载体p.MDAtJ2的构建用BamHI酶切重组质粒pMD18TAtJ2回,收长度约1.3kb的片段(AtJ2).用BamHI酶切植物表达载体pMD,回收并进行去磷酸化处理.质粒pMD的结构如图1多克隆位点(M