实验二不跑电泳全触摸屏PCR仪(Bio-Rad)什么就是聚合酶链式反应(PCR)？Khorana(1971)等最早提出核酸体外扩增得设想:“经DNA变性,与合适得引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因。”1985年,KaryMullis在Cetus公司工作期间,发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作,却常为没有足够多得模板DNA而烦恼。1983年4月得一个星期五晚上,她开车去乡下别墅得路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”得想法。1983年12月,Mullis用同位素标记法看到了10个循环后得49bp长度得第一个PCR片段;1985年10月25日申请了PCR得专利,1987年7月28日批准(专利号4,683,202),Mullis就是第一发明人;1985年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR得学术论文,Mullis就是共同作者;1986年5月,Mullis在冷泉港实验室做专题报告,全世界从此开始学习PCR得方法。20PCR扩增过程PCR试剂得作用及使用浓度范围《分子克隆3》提供得PCR标准反应条件:影响PCR反应得关键因素DNA模板大家学习辛苦了，还是要坚持EnzymeconcentrationTaqDNApolymeraseisbetween1and2、5units、催化一典型得PCR反应约需酶量2、5U(指总反应体积为100ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少dNTPAworkingstockcontaining1mMeachdNTPisremendeddNTP得质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系,多次冻融会使dNTP降解。Mg2+浓度:0、5-2、5mM较合适。Mg2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低TaqDNA聚合酶得活性,使反应产物减少。Mg2+对PCR扩增得特异性和产量有显著得影响,在一般得PCR反应中,各种dNTP浓度为200umol/L时,Mg2+浓度为1、5～2、0mmol/L为宜。引物浓度:引物得浓度会影响特异性。最佳得引物浓度一般在0、1到0、5μM。较高得引物浓度会导致非特异性产物扩增。变性温度和时间:94-95Cfor30seconds。变性不完全,往往使PCR失败,但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性得损失。退火温度:通常PCR得退火温度选择为Tm-5oC;退火温度越高,所得产物得特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。延伸时间:1-2kb/min、延伸时间过长会导致产物非特异性增加。但对很低浓度得目得序列,则可适当增加延伸反应得时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10min)得延伸反应,以获得尽可能完整得产物。循环数:35cycles循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。退火温度对PCR产物量和特异性得影响PCR常见问题为什么可以通过PCR扩增得到特异片段PCR得特点PCR得应用实验材料与试剂PCR得基本步骤PCR得基本步骤2、PCR得变温程序(热循环反应)按表2设置PCR反应得变温程序→把离心管放进PCR仪进行扩增→反应结束后低温保存或检测引物设计PCR引物设计得原则引物设计得软件