第三节动物克隆克隆(clone)是指通过无性繁殖的手段，从一个动物细胞获得遗传背景相同的细胞群或个体群的过程。获得的这些细胞叫克隆细胞，个体群称为克隆动物(clonedanimal)。广义上的动物克隆就是指动物的无性繁殖(asexualreproduction)，即用无性繁殖的手段,由单一个体产生外形、性能和基因型完全一致的多个动物。1.1克隆技术产生的历史背景1902年，德国胚胎学家HansSpermann用头发将蜥蜴2-细胞胚的两个卵裂球分开，得到与Dreisch相同的结果。结论：这一时期的每个胚细胞拥有完整的遗传信息，可以产生完整的个体。1902-1903年间，WalterSutton在蝗虫等动物上的研究发现，遗传信息的载体是染色体，染色体位于细胞核中，它在生殖细胞分裂中的行为是随机的。这一发现在人类对遗传现象的理解上具有里程碑的意义，也为孟德尔遗传定律找到了理论解释。1.2克隆技术的创立1938年，HansSpermann提出了克隆动物的设想：从一个分化细胞中提取细胞核，然后注入另一个去核的受精卵中构建新胚胎，他同时提出用体细胞进行动物克隆的思想，但一直未能付诸实施。在此期间，1944年，OswaldAvery在研究细菌转化现象时，发现遗传信息存在于核酸中，而当时人们普遍认为遗传信息存在于蛋白质上。这一发现对整个生物科学，特别是细胞核移植研究产生了巨大影响。1.3与克隆技术有关的重大成果1962年，Oxford大学生物学家JohnGurdon宣布用已完全分化的南美青蛙蝌蚪的肠细胞核克隆出完整个体，后来又从成年蛙的皮肤角质细胞克隆出了蝌蚪。1979年，德国生物学家KarlIllmensee宣布成功的克隆出了3只小鼠。1984年，丹麦科学家SteenWilladsen成功的获得了第一例胚细胞克隆绵羊。1986年，Wisconsin大学的NealFirst和RandalPrather等获得胚细胞克隆牛的成功。此后，胚细胞克隆兔（Stice,1988;黄少华，1993；王斌，1995），大鼠（Kono,1988），猪（Prather,1989；赵浩斌，1997），山羊（张涌，1991），牛（李雪峰，1996），猴（Meng，1997）等相继取得成功。1991年，Westhusin等首先报道继代克隆胚胎可以正常发育到囊胚。1993年，Stice和Keefer获得了第一、第二、第三代继代克隆牛的出生。1995年，成勇等获得第二代克隆山羊。1998年张涌等报道了第一至第五代克隆山羊的成功。1995年，RoslinIan研究所的WilmutKeith和Campbell用培养的胚盘细胞成功的克隆出了两只绵羊，表明已经有组织分化的细胞仍具有发育的全能性。1996年，Wilmut和Campell等成功地从培养的绵羊乳腺细胞得到第一只成年体细胞克隆羊（Dolly）。随后几年间，体细胞克隆牛（Kono,1998;Wells,1999），小鼠（Wakayama,1998）,猪（Onishi,2000），山羊（张涌等，2000）等相继成功。HistoryofNuclearTransfer供核动物2动物克隆技术程序解决途径：研究发现，与卵母细胞周期处于同一时期的核能更好的实现再程序化(reprogramming)。早期胚胎的卵裂球细胞可能处于各种时期，因此可用一些化学试剂对胚胎细胞进行诱导，而使它们的周期同步化。方法一：M期同步法。常用噻氨酯达唑（nocodazole）、乙酰甲基秋水仙碱（colcemid）。方法二：G1期同步法。阿菲迪霉素（aphidicolin）和羟基脲(hydroxyurea)。可使胚胎细胞分裂停止在G1/S转折期。方法三：G2期同步法。放线菌酮（cycloheximide，CHX）、6-甲基氨基嘌呤（6-dimethylaaminopurine，DMAP）。2.1.2胚胎干细胞作为核供体2.1.3体细胞作为核供体于G2期，上述现象仍发生，但由于G2期核为4倍体，因此无法正常发育；处于S期的供体细胞核进入卵母细胞后，由于染色体倍型紊乱，也不能进行后续的发育。解决途径：1.血清饥饿法。2.某些化学试剂处理。如阿菲迪霉素（aphidicolin）、丁酸内酯-Ⅰ(butyrolactone-Ⅰ)。可以使大部分细胞阻滞于G1/S期。影响因素：除了周期状态对供体细胞的核移植效果影响外，源于同一原代细胞的亚克隆系细胞之间，也因细胞基因的甲基化情况、乙酰化情况，染色体的完整性，细胞周期等不同，重构胚的发育能力也不同。另外，细胞类型不同，核移植成功率也存在差异。2.2受体胞质的选择和处理2.2.2卵母细胞的成熟及生物调控卵母细胞中的RNA合成。卵母细胞中的蛋白质合成。卵母细胞成熟分裂能力的获得。卵母细胞成