临床科研设计（诊断实验设计）带教老师：姓名：学号：班级：专业：临床科研设计[题目]：染色体荧光原位杂交(FISH)技术对急性早幼粒细胞白血病的诊断价值[立项依据]：急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种特殊类型白血病，以骨髓中含有异常颗粒的早幼粒细胞异常增生为特点。APL除具有急性白血病的共同特点外，出血症状十分突出，易并发DIC，故其早期病情重、死亡率高。但APL特有的t(15；17)(q22;q21)异位形成特异的PML-RARα融合基因，是APL发病和全反式维甲酸诱导分化治疗的分子细胞遗传学基础，经治疗后，长期无病生存率高，成为可治愈的白血病之一。故早期明确诊断、合理治疗对预后十分重要。②在世界卫生组织(WHO)提出的新的急性髓系白血病诊断分型标准中已将伴有t(15;17)易位及PML-RARα融合基因及其变异型作为诊断APL的必要条件。常规细胞遗传学检查由于受白血病细胞体外增殖不佳的限制,中期细胞数量少、质量差,导致漏检t(15;17)，检出率仅为60%～70%。因此单纯染色体核型分析并不能全面反映APL群体。同时,对于累及15,17号染色体的复杂染色体异常,核型分析也难以肯定是否有特征性分子异常,因此,进行精确的分子检查是非常必要的。③RARα基因重排是APL发病的分子基础,也是ATRA治疗APL的靶点，因此检测PML-RARα融合基因,不仅可使诊断更加准确,而且对于选择适宜的治疗方案(如全反式维甲酸或亚砷酸)至关重要。此外,它还是检测APL微小残留病及对PML-RARα融合基因进行分型的唯一手段。目前检测PML-RARα融合基因及其变异型的主要方法有荧光原位杂交(FISH)及RT-PCR,临床上最常用的是RT-PCR方法。然而RT-PCR方法由于其引物依赖性以及其他干扰因素的影响,结果容易出现假阳性和假阴性。且操作费时,不能满足临床快速、准确诊断的需求。④染色体荧光原位杂交(FISH)技术是近几年开展的新的分子遗传学技术,以其直观、快速、敏感性高和方便灵活,并可在单个细胞中检测异常等特点被广泛应用于临床研究。为进一步明确临床上表现APL特征而核型分析正常或非典型t(15;17)患者是否伴有分子异常,我们应用FISH检测此类APL患者,藉此探讨FISH在APL诊断中的应用价值。⑤低创伤性，危险性小，简单易行。⑥研究具有可行性。⑦研究对象充足。⑧实验条件具备。⑨符合社会伦理道德。[注意事项]：①有足够的研究资料证实是安全有效的；②保护受试者的权益和隐私；③经伦理委员会批准；④取得受试者的知情同意；⑤符合临床操作规范。[诊断标准的选择]：目前公认的标准，WHO标准建议将骨髓或外周血原始细胞≥20%作为急性髓系白血病（AML）的诊断标准，对有t(8;21)(q22;q22)、inv(16)(p13q22)或t(16;16)(p13;q22)等特殊染色体异位的AML，即使原始细胞比例不到20%，也可诊断。同时用法英美FAB分类法进行分型，按FAB分型急性早幼粒细胞白血病典型特征有：①90%的患者显示特异性染色体异位t(15;17)(q22;q21),形成特异的PML-RARα融合基因；临床常有严重出血且易合并DIC和纤维蛋白溶解；骨髓形态为胞质含粗大颗粒的异常早幼粒细胞增生,Auer小体阳性；化疗敏感(化疗耐药发生率≤5%，缓解生存期长但早期死亡率高)。诊断标准选择临床上最常用的是RT-PCR方法检测PML-RARα融合基因[染色体荧光原位杂交技术对急性早幼粒细胞白血病的诊断标准]：取受检者骨髓，用免疫荧光技术检测骨髓细胞中的PML-RARα融合蛋白，若见微小型荧光颗粒,布满整个细胞,平均每个细胞超过100颗,其PML-RARα融合蛋白阳性.[研究对象来源]：2009--2011年南昌大学第一附属医院经WHO诊断标准诊断为急性早幼粒细胞白血病及非急性早幼粒细胞白血病的住院病人。[入选标准及分组]：①年龄要求无差异；②性别要求无差异；③病例组要求为初诊病人；④病例组为经WHO诊断标准诊断为急性早幼粒细胞白血病的病人；⑤对照组为经WHO诊断标准诊断为非急性早幼粒细胞白血病的病人。[样本大小的计算]：n1=n2=uα2p(1-p)/δ2P：灵敏度即真阳性率，p=a/(a+c),这里p取0.9；uα=u0.05=1.96；δ：允许误差，这里取0.05；n1、n2分别代表试验组、对照组的最小样本含量；把上面数据代入公得出n1、n2的最小样本含量的大小均为139例，这里均取150例。[试验的方法步骤及注意事项]：一、试验的方法步骤：①按上述诊断标准诊断为急性早幼粒细胞白血病的病人中按入选