第二章蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题达到足够纯度的生物大分子的制备工作作为前题。沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）离心吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。沉淀法中性盐沉淀法（盐析法）有机溶剂沉淀法蛋白质沉淀法有机聚合物沉淀选择性沉淀法（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）结晶沉淀法中性盐沉淀（盐析法）中性盐沉淀蛋白质的基本原理盐分级沉淀：多次盐析的应用2)分离效果好3)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用4)价格便宜，废液不污染环境缺点：需要一定时间脱盐盐析的操作方法：固体法、饱和溶液法、透析法最常用的是固体硫酸铵加入法原则：缓慢均匀少量在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录（p24-25）中查出。盐析曲线的制作第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线蛋白质量(mg)或酶活力102030405060708090100硫铵饱和度％1)蛋白质的浓度：较适中的浓度0.2%～2.0%2)pH值对盐析的影响：pI3)温度的影响：离子强度0℃～4℃常用方法：凝胶过滤法和透析法透析法：⑴基本原理①降低水溶液的介电常数，使溶剂的极性减小②有机溶剂脱水作用①分辨能力比盐析法高②沉淀不用脱盐，过滤比较容易其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行有机溶剂的选择和浓度的计算与水互溶:乙醇、甲醇和丙酮。进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V=V0(S2－S1)／(100－S2)温度：一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高样品浓度：蛋白质初浓度：5mg/mL～20mg/mLpH值：pI附近离子强度：盐浓度<5%，V<2倍仅对一类或一种蛋白质沉淀起作用碱性蛋白质、凝集素、种金属聚乙二醇[HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH(n＞4)](PolyethyleneGlycol,PEG)亲水性强，溶于水和许多有机溶剂对热稳定有广范围的分子量在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为400～6000的PEG本方法的优点：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子③沉淀后有机聚合物容易去除原理：利用理化性质等方面的差异⑴热变性⑵表面活性剂和有机溶剂变性⑶选择性酸碱变性在特定的条件下，改变溶解度产生沉淀的方法。不等同于等电点沉淀法透析半透膜：纤维素将半透膜制成袋状袋内外两边的浓度达到平衡为止“保留液”“渗出液”或“透析液”MwCO扩散压(透析的动力)透析的速度:膜的厚度溶质的浓度梯度膜的面积温度检查透析效果的方法是：用BaCl2检查(NH4)2SO4，用AgNO3检查NaCl、KCl等制备核酸去污剂有机溶剂蛋白水解酶十二烷基硫酸钠(SDS)或Tween40……乙酸钾溶液离心除去沉淀物上清液即为初步纯化的核酸制品苯酚、氯仿上层水相(含核酸)和下层有机相界面：变性凝聚蛋白收集水相①水相和有机相的位置②充分接触，速度适当③苯酚重新蒸馏④异戊醇混合液溶菌酶蛋白酶K蛋白酶E(需灭活DNase)杂质的消除(2)DNA与RNA的分离①盐析法DNA和RNA在NaCl溶液中溶解度不同1-2mol/L;0.14mol/L②酶水解法DNase和RNase核酸沉淀核酸沉淀的形状与其分子质量密切相关>106Da：丝状纤维<106Da：凝胶(2)聚乙二醇:阶梯式浓度1.65kb的DNA，5％PEG1.2kb的DNA，6％PEG0.6kb的DNA，7％PEG(3)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)盐析曲线的制作蛋白质量(mg)或酶活力102030405060708090100硫铵饱和度％温度：一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高样品浓度：蛋白质初浓度：5mg/mL～20mg/mL