2发展过程第一篇生化分离技术第一节细胞破碎1机械破碎方法2物理破碎3化学破碎法原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构常用试剂：有机溶剂、表面活性剂4酶学破碎法外加酶制剂或自溶法第二节提取2.1水溶液提取2.1.2pH的选择不在等电点附近，但不宜太高或太低。pH3~4有利于离子键分离2.1.3温度的选择一般0~10℃（常用4℃），对于耐高温的蛋白质和酶，可适当提高温度，可使杂蛋白变性分离，有利于提取和进一步纯化。2.1.4添加底物或辅酶有利于酶的提取2.2有机溶剂提取常用有机溶剂：乙醇、丙酮、丁醇等注意：蛋白质提取应根据不同蛋白质的不同性质选用不同的提取条件3核酸的提取3.1RNA提取3.1.2苯酚水溶液提取细胞破碎→匀浆等体积90％苯酚水溶液振荡→RNA、Pro分开→RNA、多糖（水层）；DNA、Pro（苯酚层）冷酚法、热酚法，注意苯酚除杂3.2DNA提取浓盐法：1mol/L氯化钠溶液提取，＋含少量辛醇或戊醇的氯仿一起振荡除去蛋白质或：先用稀盐除去RNA－Pro，再用浓盐提取也可用苯酚法，苯酚层得到DNA、Pro第三节沉淀分离3.1盐析沉淀法蛋白质溶解度与溶液中离子强度关系：lg(S/S0)=-ksIlgS=lgS0-ksI=β-ksIβ为常数，取决于蛋白性质、T、pHks为盐析常数，与盐性质（离子价数、离子半径等）、蛋白结构有关ks越大，盐析效果越好I=(1/2)∑mizi2一定条件下，S取决于I分段盐析：ks分段盐析（β一定，pH、T一定）；β分段盐析（ks、I一定，改变pH、T）3.1.2盐的选择通常采用中性盐，最常用（NH4）2SO4，原因：水中S大，温度对S影响小，廉价易得，不易引起蛋白质变性，分段效果好。3.1.3盐析注意事项3.2等电点沉淀法3.3有机溶剂沉淀法常用丙酮、异丙酮、乙醇、甲醇等适用范围：缺点：易变性操作：低温，沉淀分离后快稀释，添加少量无机盐，pH接近pI，用量试验确定，可先浓缩。3.4选择性变性沉淀杂蛋白变性沉淀，不影响所需蛋白三核酸的沉淀分离思考题2物理破碎3化学破碎法原理：化学试剂改变或破坏细胞膜结构常用试剂：有机溶剂、表面活性剂4酶学破碎法外加酶制剂或自溶法第二节提取2.1水溶液提取3.1.2盐的选择通常采用中性盐，最常用（NH4）2SO4，原因：水中S大，温度对S影响小，廉价易得，不易引起蛋白质变性，分段效果好。3.2等电点沉淀法3.3有机溶剂沉淀法常用丙酮、异丙酮、乙醇、甲醇等适用范围：缺点：易变性操作：低温，沉淀分离后快稀释，添加少量无机盐，pH接近pI，用量试验确定，可先浓缩。3.4选择性变性沉淀杂蛋白变性沉淀，不影响所需蛋白