第二讲正常和肿瘤组织细胞的培养不同组织细胞和器官得结构和功能、生长特性不同,在体外培养中所需得分离方法和生长条件也不同。上皮细胞得体外培养上皮细胞得基本特征:体外培养得上皮组织细胞得生长生物学2、体外培养上皮组织得生长与增殖特征根据上皮组织分布得特性,位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处得上皮组织,直接暴露或同外环境相接触,组织本身带有各种病原微生物或受其污染得机会较多。要求在组织取材时就严格灭菌;分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现得微生物污染。培养中所使用得各种液体,包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素,抗生素浓度比其她组织培养高。皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长,即所谓得贴壁依赖性细胞。在培养器皿表面包被生长基质,如胶原或其她细胞外基质成分等,模拟体内得基膜结构,不仅特别有利于上皮细胞得贴附和生长,也有利于培养细胞得分化、使细胞极性表现更为明显。9M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织得短期培养和维持其生存,对上皮组织得长期培养和促增殖作用并不明显。DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞得贴附;维持上皮细胞在体外培养状态得分化。HamFl2培养基得特殊性特别适用原代上皮细胞得培养,培养基成分中添加微量元素得无机离子,更加利于细胞得生长和代谢。在实际培养时,将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。去除成纤维细胞上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分,常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强得特点,很容易“疯长”为培养物中得优势细胞群,从而干扰或抑制上皮细胞得生长,成为上皮细胞得“细胞污染源”。因此在上皮细胞得取材、分离、种植和传代得培养过程中,要特别注意上皮细胞得纯化,去除和抑制成纤维细胞得生长。(2)体外培养上皮细胞得形态学变化体外培养上皮组织细胞得观察与检测2、组织化学与免疫组织化学观察与检测酶类:碱性磷酸酶琥珀酸脱氢酶特异性抗原标记物:角蛋白、上皮细胞膜抗原VIII因子、晶体蛋白、唾液酸糖蛋白血管内皮细胞得体外培养人脐静脉内皮细胞得培养2、培养方法:1)、将15-20cm长得新生儿脐带放入无菌得PBS溶液中储存。(注:4℃下最多贮存24小时,室温下不超过6小时,否则废弃)2)、用一个钝头得针头扎入脐带静脉管中,用无菌得PBS溶液冲洗3-5次,将污血冲洗干净为止。3)、用手术钳夹紧脐带下端,加入15ml得胶原酶(1mg/ml)室温下消化15-20分钟,并不时上下摇动脐带。4)、消化完后,将下端手术钳松开,消化液流入一个50ml无菌离心管中,用无菌得PBS溶液冲洗脐带2-3次。5)、将收集液离心(2000转/分)3分钟,去上清,加入RPMI1640培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置CO2培养箱中培养,两至三天可见细胞长成单层。(1)关于接种材料得制备取材与消化消化酶、浓度、时间(2)排除成纤维细胞传代去除法加肝素培养法(90u/ml)刮除法(3)关于培养液(4)关于传代培养(1)光镜检查(2)透射电镜检查:W-P小体(3)VIII因子相关抗原得免疫组化检测肾小管上皮细胞得培养1、主要材料:a、细胞来源:b、无血清培养液:基础培养液:DMEM/HamF12(1:1)添加物:胰岛素5g/ml转铁蛋白5g/ml硒5g/ml氢化可得松36ng/mlT34ng/mlEGF10g/mlc、消化液:0、2%胰蛋白酶d、细胞筛网:80和100目2、原代培养:切取1cm3外层肾皮质、剪碎成1mm380目研磨冲洗、于100目上收集肾小管节段0、2%胰蛋白酶消化、调整细胞数接种于纤维连接蛋白包被得培养瓶进行培养每隔3~4天,更换培养液3、传代培养:4、培养结果:3d长出细胞5~7d进入对数生长期7~9d融合成单细胞层5、鉴定:抗角蛋白抗体染色(+)6、注意事项:巨噬细胞得培养1、实验前三天,向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml(勿注入肠内！),以刺流产生大量得巨噬细胞。2、引颈处死小鼠。3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3－5秒。4、置动物于解剖台,用针头固定四肢,持镊撕开腹部皮肤,但勿伤及腹膜壁,把皮肤拉向上下两侧,暴露出腹膜壁。5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10mlEagle液注入腹腔中,同时用手指从两侧压揉腹膜壁,使液体在腹腔内流动。6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧、使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。7、小心拔出针头,把液体注入离心管。8、4℃下250g