武汉生物工程学院毕业论文开题报告题目名称烟色曲霉原生质体制备与紫外诱变题目类别毕业论文系别生物工程系专业班级08014101学生姓名张尚昆指导教师周念波辅导教师黄英开题报告日期2011.09研究现状：1原生质体及其诱变Weibull等人于1953年首先提出原生质体（protoplast）概念。原生质体是指细胞壁被酶水解剥离后，剩下由原生质膜包围的原生质部分。原生质体的形状随不同菌类而异。原生体基本保持原细胞结构、活性和功能，只是因为去掉了细胞壁，对渗透压和外界环境特别敏感。为制备原生质体，必须有效地除去细胞外的细胞壁。去壁的方法有机械法、非酶分离法和酶法。实际工作中绝大多数采用酶法，时间短，效果好。并且原生质体通常是由对数生长期的细胞制备而来的，因其代谢旺盛、复制频繁、生活力强、对诱变剂的敏感性也强，诱变后易于形成单菌落而便于筛选。2曲霉原生质体的生物学特性原生质体与完整细胞相比，细胞结构和功能是相类似的；来自不同菌丝部位的原生质体，生理生化特性不同，对诱变剂的敏感也不同，从菌丝顶端分离出的原生质体代谢活动要强；去壁后的原生质体对外界条件敏感，并且外界大分子如外源DNA等容易进入细胞内；原生质体在一定条件下容易再生成细胞壁而复原为完整细胞形态；原生质体由于剥去了细胞壁，等于失去了屏障，外界的因素本身对它就有影响，再加上用诱变剂诱变，对原生质体的变异作用更强。因此可以提高诱变强度，增加诱变的力度，提高高频诱变的机率，使菌株变异的幅度大大加强，有可能从中筛选出变异特性更强、性状改变更大的菌株。3烟色曲霉原生质体的释放过程烟色曲霉原生质体和其他许多常见丝状真菌一样，可以从菌丝顶端和其他部位释放，同时出现菌丝膨大变形，这是由于细胞壁已被水解掉，细胞膜凸出将要成为原生质体。原生质体释放时，通常是在菌丝体的释放部位先膨大形成一个小球体，然后该球体逐渐增大，最后脱离菌丝，有的还可以在原有的释放部位紧接着又形成一个或几个原生质体，这可能是由于菌丝体有关泡囊形成与细胞膜融合的机制所导致的。有报道认为，在菌丝上缓慢膨大脱落的原生质体较为稳定，很快形成的原生质体则很脆弱。释放的原生质体多呈球形，大小不一，直径为1μm-20μm，但以直径为5μm-10μm的中等大小的原生质体最多，其原生质体中一般含一个巨大的液泡，其余的内含物呈月牙形，透明性较液泡差。4烟色曲霉原生质体的制备制备原生质体是原生质体技术的前提和基础，但是不同微生物的细胞壁组成各不相同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。早期人们曾探索使用研磨等机械方法和超声波等物理方法来制备原生质体，制备效果都不理想，目前人们主要运用酶法来制备原生质体。对于烟色曲霉，由于其细胞壁组成较为复杂，人们多倾向于使用复合酶进行处理，常用的酶有纤维素酶、蜗牛酶和几丁酶等。不同曲霉菌种在制备原生质体时菌丝的菌龄、菌体预处理，而且所需酶体系的酶解液配比、酶处理的温度和时间、PH及其他因素也存在着差异。4.1菌龄对原生质体制备的影响微生物生理状态是决定原生质体产率的主要因素之一，菌龄明显地影响原生质体的产率。随着培养时间的不同，菌体原生质体的产率也不同，处于对数生长期的菌体更容易酶解生成原生质体。4.2酶液的pH对原生质体制备的影响原生质体制备液的pH值也可以直接影响到原生质体的制备。因为只有在最适pH值时，酶的活性才最高，酶促反应速率才最大。4.3不同的酶系统对原生质体形成的影响真菌细胞壁的成分和结构变化很大,因其种类、部位、发育阶段以及培养方式而不同,因此酶解所需酶的种类、浓度以及酶解时间等要求不同。以蜗牛酶、纤维素酶的不同组合对最佳的破壁用酶及其条件进行优化。4.4酶作用时间对原生质体制备的影响酶解时间越长，细胞脱壁越完全，而原生质体的再生需要一定的细胞壁的酶解残余物作为引物，所以如果酶解时间过长，必然会影响原生质体再生率。4.5酶作用温度对原生质体制备的影响酶解温度也可以直接影响到原生质体化程度。烟色曲霉的最适酶解温度为30℃-37℃。一般来说，最适酶解温度都要高于微生物的最适生长温度。在低于最适酶解温度时，随着温度的升高，原生质体制备率不断提高，高于最适酶解温度，原生质体的产量明显减少。5原生质体的紫外诱变微生物在一定酶的作用下，脱去细胞壁，只有在高渗压培养基中存活，并在合适的培养基中恢复细胞壁而再生。由于原生质体失去细胞壁的屏障，故对环境、诱变剂等更为敏感，因此用原生质体作为诱变材料，诱变效果较传统方法理想。原生质体失去了细胞壁的屏障，外界的因素本身对它就有影响，再加上对其进行紫外诱变过程，诱变后易于形成单菌落，便于分离筛选，并且原生质体具有细胞壁再生能力，又保持细胞全能性。原生质体诱变经常会引起较多