Venter人造生命阅读笔记1977年，Sanger和他的同事完成噬菌体ΦX174的基因测序工作。随着技术的发展，18年后，Venter带领他的团队率先完成了第一个细菌—流感嗜血杆菌的的基因组测序工作。但是，就当时的技术条件而言，测序的准确性和速度都处于很低的水平，存在着万分之一的出错率，而且完成一个微生物的测序工作需要数月的时间。最近几年，伴随着测序技术的发展，基因测序的保真度和速度都有了极大的提高，也有利地促进了合成生物学的发展。但Venter之前的基因工程途径仅仅是在原有基因组中插入、替换或者敲除某些基因，以实现对生物体性状、代谢途径的改变、调节与控制。Venter和他的同事考虑到，是否可以构造一个完全由人工合成的基因组控制的细胞。于是，Venter与同事从1995年完成生殖支原体（Mycoplasmagenitalium）的测序工作开始，用了15年时间，花费大量人力物力，终于成功地合成了生殖支原体与丝状支原体（Mycoplasmamycoides）的基因组，在将丝状支原体基因组转入山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)后，产生可独立生活、自我复制的支原体,其性状与丝状支原体相同。由于生殖支原体基因组很小，只有约583kb，所以Venter首先想到人工合成生殖支原体的基因组，将基因组转入受体细胞后，创造一个只含人工合成的遗传物质的细胞。但是，由于生殖支原体的生长率过低，Venter只能选择合成丝状支原体基因组，然后转入山羊支原体受体细胞中，产生合成的丝状支原体细胞。Venter的合成基因主要是基于CP001621序列，并人为地加入4个对细胞生存没有影响的水印基因以及一些特定的限制性内切酶位点。根据序列结果，Venter用化学方法合成了1078个约含1080bp的碱基片段，每个片段两端含有约80个重叠部分，使其可以通过重组连接在一起。用质粒将片段连接后，分组导入酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）细胞内，通过重组形成109种长度约为10080bp的片段，然后将它们连同质粒一起转入大肠杆菌（Escherichiacoli），通过质粒的复制获得大量人工合成片段的拷贝。裂解大肠杆菌后，通过电泳筛选、回收含有人工合成片段的质粒，重新测序检验后，没有错误的进行下一步的重组。然后将上一步中获得的片段，按一定顺序再次重新分组转入酵母细胞，通过重组产生11种长度约为100kb的基因组片段。但由于这一步骤产生的片段及其载体过大，不能在大肠杆菌细胞内稳定的扩增，因此，将片段从酵母细胞中提取出来之后，不再转入大肠杆菌细胞内，而是在体外利用多重PCR技术扩增产生大量拷贝。然后通过琼脂糖电泳检测是否出现缺失或者重复的片段。（个人认为还需要对所得产物测序，但文献没有提及）。在进行第三步装配之前，Venter又进行了半合成基因组的装配与转入实验，用以检测装配的11个100kb的片段的功能性，即将人工合成的片段与WT的基因片段装配，并转入山羊支原体细胞，观察其生长情况。实验发现，只装配801-900kb片段的菌株不能正常生长，进一步检测发现801-820kb中一个碱基对缺失，影响一个生长必须基因的正常表达，而在合成装配未发现此错误。于是，Venter又重新进行了801-900kb的合成与装配。多重PCR扩增后的产物，用外切酶酶切后，阴离子交换层析，然后通过倒转电场凝胶电泳可以获得纯化的100kb大小的装配体及其载体。然后进行特殊的电泳方式进一步纯化装配产物，具体方法是，先将产物掺入琼脂糖中，接着进行电泳，那些线状分子由于不能被纤维阻挡而电泳出去，从而获得更加纯化的样品。纯化后的样品用限制性内切酶酶切后释放装配体，然后将产物再次转入酵母细胞，重组得到完整的丝状支原体基因组，再次多重PCR扩增获得大量拷贝。在筛选过程中，一个菌株成功重组出11个装配片段，其与自然菌株PCR产物没有明显差别。为了更进一步检测产物，将完整人工合成基因组从酵母中提取后，用限制性内切酶AscI和BssHII进行酶切，由于酶切位点处于水印基因序列中，即可以证明所得基因组确实是又人工合成的。完成基因组的合成之后，要解决的问题是将基因组转入受体细胞中。支原体细胞中，基因组部分序列被甲基化，而酵母细胞中限制系统不同，故在酵母细胞中重组的合成丝状支原体基因组由于甲基化不完全，不能在山羊支原体中正常表达。解决方法有：1.在体外用甲基化酶对合成基因组进行甲基化。2.在体外用支原体粗提物对合成基因组进行甲基化。3.破坏山羊支原体限制系统。Venter采用甲基化酶在细胞外对合成基因进行甲基化，然后转入受体细胞，使其正常表达。合成基因组转入细胞后，利用SP4四环素培养基，在半乳糖苷作用下筛选转入合成基因组并成功表达的菌株，由于WT菌株不含lacZ基