原生质体融合技术及其应用胡庆如09生科134001091002（邯郸学院生物科学系河北邯郸056005）摘要:原生质体融合技术是微生物遗传育种上的一项重要技术,它具有遗传信息传递量大,不受亲缘关系的影响,可有目的地选择亲株以选育理想的融合株,便于操作等优点,在菌种选育中具有广阔的应用前景。本文从原生质体的制备及其影响因素、原生质体融合的促融方法、原生质体融合子的筛选以及融合技术在微生物菌种选育中的应用等方面进行了综述。关键词:原生质体融合;菌种选育;生物技术;应用原生质体融合育种(protoplastfusion)是20世纪60年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象,同时日本的Dkada发现仙台病毒可诱发内艾氏腹水病细胞彼此融合,从而开始了细胞融合的探索。1974年匈牙利的Fereczy[1]采用离心力诱导的方法实现了白地霉(Creotrichumcandidum)营养缺陷型突变株原生质体的融合;随后人们相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合,但融合率比较低;1978年国际工业微生物遗传学讨论会提出了原生质体的融合问题,使这一技术迅速扩展到了育种领域;1979年匈牙利的Pesti首先提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量的报告[2],从而开创了原生质体融合技术在工业微生物育种实际工作中的应用。从此,原生质体融合育种广泛应用于霉菌、酵母菌、放线菌和细菌,并从株内、株间发展到种内、种间,打破种属间亲缘关系,实现属间、门间,甚至跨界融合。1原生质体融合技术简介原生质体融合就是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍———细胞壁,释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体,然后用物理或化学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合,经染色体交换、重组而达到杂交的目的,经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。原生质体融合与常规杂交相比有多方面的优势,除了能显著提高重组频率外,还具有定向育种的含义。此项技术能把亲缘关系比较远,甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起,为远缘杂交架起了桥梁,是改造细胞遗传物质的有力手段,它不仅在于打破了有性杂交重组基因创造新种的界限,更重要的是扩大了遗传物质的重组范围。微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生。2原生质体融合技术详解2·1原生质体的制备与再生技术微生物细胞一般是有细胞壁的,进行该项技术的第一步就是制备原生质体。当前去除细胞壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差,活性低,仅适用于某些特定菌株,因此，并未得到推广。在实际工作中,最有效和最常用的是酶法。该法时间短效果好。使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体形成的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长期或生长中后期的菌,也有的采用生长后期的,这主要是由于对数生长期细菌的壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感,但是对数生长早期的菌相对较为脆弱,受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。彭智华[3]等对野生大杯蕈(Clitocybemaxima)进行原生质体制备的过程中,用2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。陈海昌[4]等证明,在一定范围内,酶作用的时间、酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关,而与再生率成反相关。林红雨[5]等采用酶解10min后补加EDTA的方法,改变酶解环境中的离子强度和渗透压,可以提高原生质体形成率。Coster-onJ·W·[6]等(1967)报道,在高渗Tris溶液中添加115%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等原生质体扩张剂,有助于制备原生质体,添加0·02mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。2·2原生质体融合的促融方法由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非常低,所以在实际育种过程中要采用一定的方法进行人为地促融合。当前常用的方法主要有:化学法、物理法和生物法等。这几种方法各有其自身的特点,在进行实际工作中可根据操作对象选择适合的融合方法。2·3遗传标记的选择与融合子的检出假设用于原生质体融合实验两亲本的基因型分别为A和B型,那么经诱导融合,整个群体中含有五种类型:A,AA,AB,BB,B。其中只有AB型才有可能形成真正的杂种细胞,而其余四种类型必须淘汰。所以考虑采用一种行之有效的筛选方法是原生质体融合实验里至关紧要的一环。下面介绍几种常用的筛选方法。2·3·1利用营养缺陷型作为遗传标记选择融合子[7]即融合的双亲为营养缺陷型,并且为不同的缺陷型。双亲缺陷的原生质体融合后于基本培养基上选择融合子,缺陷