第三章蛋白质改造的分子途径及其蛋白质的异源表达第二节蛋白质改造的分子生物学途径1．寡核苷酸介导的位点特异性突变(1)寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素关于DNA模板的制备双链DNA模板：质粒单链DNA模板：M13噬菌体载体，足够纯净(避免RNA污染)②寡核苷酸突变引物的设计和选择引物特征：具有和模板DNA的互补区；足够长，能与目标DNA序列退火；突变引物应尽可能避免形成稳定二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列；突变引物不能与目标DNA的其它区域和载体DNA形成稳定的杂交体。引物设计取决于所要产生的突变类型：用于单个核苷酸改变的引物，一般长度为17－19个核苷酸；多处改变核苷酸或改变2个以上，一般长度为25个核苷酸以上。⑤存在于dNTP中的dUTP对离体DNA合成反应的影响⑥受体细胞对突变体产率的影响(2)几种寡核苷酸介导的基因突变方法①Kunkel突变法②基于抗生素抗性“回复”的突变方法③基于去除特定限制酶切位点的突变PCRflash2．区域性定向突变盒式突变的两个关键问题：第三节重组蛋白质的表达一．表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。根据受体细胞的不同可分为：1．原核表达系统(大肠杆菌)：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达、合成基因产物的体系。2．真核表达系统（哺乳动物细胞）：使外源基因在真核细胞中表达的体系。二．原核生物基因结构和表达特点原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。3、一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统4、原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位5、原核生物中参与转录的基因结构：启动子终止子启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。一般长40-60bp，富含A-T碱基对具有保守序列：-10区（pribnowbox）：TATAAT-35区：终止子（terminator，T）:位于基因3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列6、与转译有关的原核细胞结构：——核糖体结合位点转译起始密码子AUG或GUGSD顺序（shine-dalgarno）：AUG上游3-11bp长约3-9bpmRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列三．外源基因在原核表达系统中表达的必要条件：删除内含子和5’非编码区外源基因置于强启动子和SD顺序控制下维持正确开放阅读框架（ORF）mRNA稳定且可有效转译，形成的蛋白质不被降解四．影响外源基因在原核细胞中表达效率的因素：1、启动子：建立表达载体时，选择强启动子。常见原核强启动子：Plac：受Lac阻遏蛋白负调，受IPTG的诱导Ptrp：取自大肠杆菌色氨酸操纵子。Ptac:Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。PL和PR启动子：噬菌体早期左/右向启动子，受λ噬菌体CI基因负调控。温度诱导。2、基因剂量：3、核糖体结合位点：SD顺序与16srRNA3’末端互补程度。AUG—SD间距离。AUG后的核苷酸五．原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子SD顺序筛选标志其它调控基因（一）融合型表达载体技术关键：克隆基因插入原核序列3’端而维持正确阅读框架。选择合适酶切位点加入人工合成的DNA接头构建位相载体优点：表达效率高产物稳定易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可鉴定易纯化：利用融合原核多肽的特性Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：pGEX-1T—凝血酶pGEX-2T---凝血酶pGEX-3T---X因子位相载体（二）非融合型表达载体主要元件：强启动子SD：ATG：第一个密码子非融合型表达载体----pPL-Lamda（三）分泌型表达载体：1、主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：SD下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。分泌型表达载体----pINIII-ompA1分泌型融合表达载体----pEZZ18六．提高表达水平的手段1、选择合适载体，提高翻译水平强启动子----提高转录水平核糖体结合位点（ATG---SD）避免产物降解：分泌/融合表达细菌蛋白酶抑制剂2、选择合适宿主Lac启动子----LacI菌PL/PR--------CI857溶源菌3、诱导表达温度诱导------PLPR/IPTG的化学诱