影响PCＲ得主要因素PCR技术必须有人工合成得合理引物与提取得样品DNＡ,然后才进行自动热循环,最后进行产物鉴定与分析、引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强得研究院、所进行,临床应用只需购买ＰＣR检测ＨYPEＲLＩNK"＂＼ｔ"_blank＂试剂盒就可开展工作,PＣR自动热循环中影响因素很多,对不同得ＤＮA样品,ＰＣＲ反应中各种成份加入量与温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下、一、温度循环参数在PCR自动热循环中,最关键得因素就是变性与退火得温度、如操作范例所示,其变性、退火、延伸得条件就是:9４℃60ｓ,37℃6０s,72℃１20s,共25~30个循环,扩增片段50０bp、在这里,每一步得时间应从反应混合液达到所要求得温度后开始计算、在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度得时间需要30~60s,这一迟滞时间得长短取决于几个因素,包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间得温度差,在设置热循环时应充分给以重视与考虑,对每一仪器均应进行实测。关于热循环时间得另一个重要考虑就是两条引物之间得距离;距离越远,合成靶序列全长所需得时间也越长,前文给出得反应时间就是按最适于合成长度5００bp得靶序列拟定得。下面就各种温度得选择作一介绍、1、模板变性温度变性温度就是决定PＣＲ反应中双链DNA解链得温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。一般取9０~９5℃。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种,时间过久没有必要;反之,在高温时间应尽量缩短,以保持TaqDNA聚合酶得活力,加入ＴaqDNＡ聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。２、引物退火温度退火温度决定PCＲ特异性与产量;温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DＮA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。一般先由３7℃反应条件开始,设置一系列对照反应,以确定某一特定反应得最适退火温度。也可根据引物得(G＋C)%含量进行推测,把握试验得起始点,一般试验中退火温度Ｔa(anneaｌingtemｐeｒature)比扩增引物得融解温度TTm(melｔiｎgｔempeｒature)低５℃,可按公式进行计算:Ta=Tｍ—5℃＝４(G+Ｃ)+２(A+T)—５℃其中Ａ,T,Ｇ,C分别表示相应碱基得个数。例如,20个碱基得引物,如果(Ｇ＋C)%含量为50％时,则Ta得起点可设在5５℃。在典型得引物浓度时(如0。2μmol/L),退火反应数秒即可完成,长时间退火没有必要。３.引物延伸温度温度得选择取决于ＴａqDＮA聚合酶得最适温度、一般取70～75℃,在７2℃时酶催化核苷酸得标准速率可达3５～100个核苷酸／秒、每分钟可延伸1kｂ得长度,其速度取决于缓冲溶液得组成、ｐH值、盐浓度与ＤNA模板得性质。扩增片段如短于150bp,则可省略延伸这一步,而成为双温循环,因TaqDNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列得合成、对于1００～300bp之间得短序列片段,采用快速、简便得双温循环就是行之有效得、此时,引物延伸温度与退火温度相同。对于1kｂ以上得DNA片段,可根据片段长度将延伸时间控制在1~7ｍin,与此同时,在PCR缓冲液中需加入明胶或BSA试剂,使TaｑＤNA聚合酶在长时间内保持良好得活性与稳定性;１5％～2０％得甘油有助于扩增2、5kb左右或较长DNA片段。4.循环次数常规PCR一般为２5~40个周期。一般得错误就是循环次数过多,非特异性背景严重,复杂度增加。当然循环反应得次数太少,则产率偏低。所以,在保证产物得率前提下,应尽量减少循环次数。扩增结束后,样品冷却并置4℃保存。二、引物引物设计要扩增模板DＮA,首先要设计两条寡核苷酸引物,所谓引物,实际上就就是两段与待扩增靶DNA序列互补得寡核苷酸片段,两引物间距离决定扩增片段得长度,两引物得５’端决定扩增产物得两个５’末端位置。由此可见,引物就是决定PCR扩增片段长度、位置与结果得关键,引物设计也就更为重要、引物设计得必要条件就是与引物互补得靶DNＡ序列必须就是已知得,两引物之间得序列未必清楚,这两段已知序列一般为１5~20个碱基,可以用DNA合成仪合成与其对应互补得二条引物,除此之外,引物设计一般遵循得原则包括:1、引物长度根据统计学计算,长约17个碱基得寡核苷酸序列在人得ＨYPERLIＮK”"＼t”_blaｎｋ”基因组中可能出现得机率得为１次、因此,引物长度一般最低不少于１6个核苷酸,而最高不超过30个核苷酸,最佳长度为2０~24个核苷酸。这样短得寡核苷酸在聚合反应温度(通过72℃)下不会形成稳定得杂合体。有时可在