酶联免疫吸附实验掌握酶联免疫吸附实验（ELISA）的原理熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法了解其他免疫标记技术二、实验原理是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位分类：免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定。免疫标记技术=是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。Ag+AbEAgAbE+底物呈色反应是一类常用的酶免疫技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。ELISA过程包括：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体,再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。同理也可包被抗体，测定抗原含量。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。常用酶及其底物ColorimetricELISASubstratesELISA常用的几种方法(一)测定抗原的，主要有四种方法1.竞争法2.双抗体夹心法3.改良的双抗体夹心法4.抑制性测定法。(二)测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也是目前最常用的方法.HBV感染后的血清学指标:实验材料微孔条已经包被HBsAb1、编号：微孔条按顺序编号。2、加样：分别加入待检血清、阳性血清、阴性血清各50ul，空白对照。3、加入酶结合物：每孔中加入酶结合物50ul，空白对照孔不加，轻拍混匀。4、温育：贴上胶纸，37℃温育30分钟。5、洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完往后扣干（每次保持30-60秒的浸泡时间）。6、显色：每孔加底物A、B各50ul，轻拍混匀，封口，37℃暗置10-15分钟。7、终止：每孔加终止液50ul，轻拍混匀。8、测定：用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值，并记录结果，读数在加终止液10分钟内完成。结果判定：1、临界值（CO，cutoff）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值N×2.1。2、阴性对照孔OD(opticaldensity)均值大于0.1时重新实验，小于0.05时以0.05计算。结果判定：样品OD值S/CO≥1者为阳性，样品OD值S/CO＜1者为阴性。四、注意事项五、ELISA的影响因素（一）固相载体（二）抗原（三）试验样品（四）结合物（五）洗涤剂与稀释剂（六）底物（1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经酶催化后有明显的颜色变化，这样可使结果分辨清楚；（2）所显色泽易干洗脱；（3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的；（4）价廉，易得而且无毒。（七）作用时间（八）结果判断(九)试验的重复性（精确度）4、以“比值”表示：求出被检标本的O.D值与一组阴性标本O.D值的比值，例如为阴性标本的2倍或3倍，即为阳性，比值小于2.1而大于1.5为可疑，<1.5为阴性。测定标本O.D值-空白O.D值—————————————≥2.1阴性对照O.D值-空白O.D值如在此测定时以空白校正“O”点。5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上找出相应的单位数，再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。（十）对使用仪器要求ELISA应