藏猪雌激素受体（ESR）基因PvuⅡ多态性分析赵中权赵中权（1977-），男（汉），四川南江人，在读硕士研究生，专业方向：分子标记与动物育种。帅素容（责任作者）（1963-），女（汉），四川青神人，博士，专业：动物遗传育种与繁殖。帅素容1李平2甘万华3高鹏1四川农业大学动物科技学院四川雅安625014；2.甘孜州畜牧科学研究所四川康定626000；3.四川省稻城县畜牧局四川稻城627750)摘要:用PCR-RFLP方法检测了88个藏猪个体的雌激素受体（ESR）基因的PvuⅡ多态性。结果表明，A、B两等位基因的频率分别为43.75%和56.25%，B等位基因频率显著地高于A等位基因的频率(P＜0.05)，说明藏猪具有较高的繁殖性能，为藏猪品种资源保存和合理开发利用提供了科学依据。关键词：藏猪；ESR基因；PCR-RFLP；繁殖性能1前言雌激素受体(EstrogenReceptor,ESR)是一种与特定激素应答DNA元件(EstrogenResponseElements,ERE)相结合的激活转录因子，由Jenson和Jacobson首先在子宫、阴道等靶组织中发现，它广泛存在于各种动物体内，参与雌性脊椎动物性腺组织基因的表达与调控。结合了配体的ESR与雌激素应答元件（ERE）相互作用，可以改变受激素调控基因的转录，进一步影响雌性第二性征、繁殖周期、生殖力、妊娠维持，从而影响胚胎发育和系统分化。进而影响家畜的繁殖性能及其它生产性性能。现已研究证实，猪雌激素受体基因是控制猪产仔数的主效基因。藏猪是世界上分布海拔最高地区的放牧型猪种，能适应高原的恶劣气候和低劣饲料环境。具有体型小，鬃毛发达，体质结实紧凑，皮薄，肌纤维细，肌间脂肪含量高，肉质好等特点。据《四川家畜家禽品种志》记载，在放牧条件下藏猪的繁殖性能较低，初产母猪产仔数平均4.5±0.1头，第二胎平均5.4±0.2头，三胎以上平均5.6±0.2头[1]。但据作者在四川省稻城县走访调查结果表明，藏猪繁殖性能不亚于四川其它猪品种，经产母猪平均窝产仔数也能达10头以上。本文对藏猪雌激素受体基因进行PvuⅡ酶切多态性分析，旨在从分子水平上研究藏猪繁殖性能，为藏猪种资源的保护和合理开发利用提供科学依据。2材料与方法2.1材料来源本研究样品（88个藏猪个体）随机取自四川省稻城县藏猪原种保护区，采集到的组织样品在-20℃冷冻后，用冷藏箱带回实验室，-70℃条件下保存备用。2.2实验方法2.2.1基因组DNA提取：用酚/氯仿法从猪耳组织细胞中提取基因组DNA。2.2.2引物及PCR反应引用ShortTH等（1997）公布的引物[2]，由上海生工生物技术服务有限公司合成。其序列为：ESRF：5'-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3'ESRR：5'-CACTTCGAGGGTCAGTCCAATTAG-3'扩增的特异片段长度约为120bp，位于ESR基因的第5外显子。PCR反应体系：PCRbuffer（含MgCl225mmol）4µlMgCl22.5µldNTPs(2.5mmol/L)4µlPrimers(10pmol/µleach)1.3µlTemplateDNA（1.19µg/µl）4µlTaqDNApolymerase(5U/μl)0.5µl加水至25µlPCR反应条件：940C预变性4分钟，550C退火45秒，720C延伸1分钟，然后进入如下循环：（94℃1分钟,55℃45秒，72℃1分钟）×35；循环结束后，72℃延伸8分钟；40C保存。2.2.3PCR-RFLP分析依据所选用的限制性内切酶(PvuⅡ)的酶切条件进行酶切，其反应体系为：限制性酶缓冲液（10×Mbuffer）2.0µl扩增产物12.5µl限制性内切酶PvuⅡ(15U/ul)1.0µl加灭菌超纯水至20µl37℃水浴4小时后，取出10000转/分离心2分钟。2.2.4检测方法2.2.4.1PCR产物检测取PCR扩增产物4µl用3%琼脂糖(含GoldView染料)检测，60-80伏电泳40分钟，凝胶成相系统扫描记录电泳图谱。2.2.4.2酶切产物的检测扩增产物经限制性内切酶PvuⅡ消化后，40-60伏4.5%琼脂糖凝胶(含GoldView染料)电泳2-4小时，凝胶成相系统扫描记录电泳图谱。3实验结果及分析3.1PCR结果PCR扩增结果见图1，由图1可见所扩增的目的片段为一明显亮带，且无杂带，该扩增片段长约120bp，与预测的结果一致。图1ESR基因PCR扩增产物3%琼脂糖凝胶电泳图谱Fig1.ElectrophoreticpatternofPCRproductsofESRgene3.2PCR-RFLP结果