原位杂交组织化学核酸分子杂交技术定义：特定标记的已知序列的核酸作为探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对标记的探针进行检测的方法称为原位杂交。分类原理优点应用原位杂交流程缺刻平移法标记DNA探针DNANicktranslationDNARandomprimedlabelingRNAprobelabeling原位杂交条件的选择增强组织的通透性和核酸探针的穿透性杂交Tm＝79．8一D十0.584×％GC十16×lg[Na＋]一F×(％formamine)一LD：是用来校正各种不同类型杂交体热稳定性的差别系数。DNA：DNA10DNA：RNA5RNA：RNA0％GC：杂交体中G十C碱基的百分比。[Na＋]：杂交液中单价阳离子的摩尔浓度。F：是由甲酰胺引起的Tm下降常数，在DNA：DNA、DNA：RNA和RNA：RNA杂交中，F值分别为0.65、0.5和0.35。(％formamine)：杂交液中甲酰胺的百分比浓度。L用以校正双链长度对Tm的影响。杂交体双链的热稳定性随着其长度的缩短而降低。L值可用公式计算：L＝B／I。其中B＝300十2000[Na＋](Na＋应为0.05一0.5mol)，I为双链的长度，用bp表示。杂交后处理使用地高辛标记的RNA探针的冰冻切片的原位杂交实验准备探针的标记取材：根据需要把材料切成3-5mm的小块迅速投入，液氮中，-70ºC保存。切片：10µM，-70ºC保存室温干燥30分钟或50ºC、2min固定：4%多聚甲醛（pH9.5）室温固定1小时洗涤：1×PBS，2×3min蛋白抽提：1%Tron-100，室温20min预杂交室温15min，预杂交液：5×SSC，50%甲酰胺杂交：55ºC，16小时以上杂交液：5×SSC50%甲酰胺0.02%BSA250µg/mlTrna10%硫酸葡聚糖1µg/ml变性探针杂交后处理：50%甲酰胺5×SSC，15min×1，55ºC50%甲酰胺2×SSC，30min×1，55ºC50%甲酰胺0.2×SSC，30min×2，55ºC0.2×SSC，5min×1，室温Buffer15min×1，室温1%Blooking1hr室温0.5%Blooking+碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体1：50004ºC过夜原位杂交中注意的问题：杂交前处理要严格避免RNA酶的污染。杂交前后的仪器、器皿、药品要分开使用。杂交前使用的器皿、试剂严格处理。杂交前操作带手套。实验结果的判定课堂测验原理RNAprobelabelingTm＝79．8一D十0.584×％GC十16×lg[Na＋]一F×(％formamine)一LD：是用来校正各种不同类型杂交体热稳定性的差别系数。DNA：DNA10DNA：RNA5RNA：RNA0％GC：杂交体中G十C碱基的百分比。[Na＋]：杂交液中单价阳离子的摩尔浓度。F：是由甲酰胺引起的Tm下降常数，在DNA：DNA、DNA：RNA和RNA：RNA杂交中，F值分别为0.65、0.5和0.35。(％formamine)：杂交液中甲酰胺的百分比浓度。L用以校正双链长度对Tm的影响。杂交体双链的热稳定性随着其长度的缩短而降低。L值可用公式计算：L＝B／I。其中B＝300十2000[Na＋](Na＋应为0.05一0.5mol)，I为双链的长度，用bp表示。