大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的不同鉴定方法的研究[摘要]目的采用5-氮杂胞苷(5-aza)诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞。然后用免疫组化的方法鉴定actindesminctntp38mark的表达方法分离培养骨髓间充质干细胞,采用密度为1.073的percoll分离液分离大鼠骨髓间充质干细胞并进行体外培养和连续传代,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫组化的方法鉴定actindesminctntp38mark表达。结果诱导前,骨髓间充质干细胞形态均一,呈多突起扁平形态,诱导后细胞形态发生变化,细胞之间形成连接,排列方向渐趋一致,免疫组化显示表达。结论:[关键词]骨髓间充质干细胞；心肌细胞；大鼠；actin；desmin；ctnt；p38mark现有的研究资料表明,骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)取材容易,体外扩增力强且在一定的条件下能向心肌细胞方向分化,为心衰干细胞移植治疗提供一种理想的种子细胞。1.1材料与方法1.1.1药品和试剂1.1.2实验动物:1.2方法1.2.1MSCs的分离培养:将大鼠颈椎脱臼处死后,置于75%酒精浸泡约5min,于无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨,用注射器冲出骨髓细胞后,经5ml注射器吹打制成单细胞悬液备用,然后缓慢将细胞悬液注入预先加有密度为1.073的percoll细胞分离液的试管中,4℃1500r/min离心15min,取中间的单个核细胞层,用DMEM培养液清洗2次,以1×106/ml密度接种于50ml培养瓶中,在5%CO2饱和湿度、37℃培养箱中进行原代培养,3d后更换新鲜培养液,去除未贴壁细胞,原代培养一旦铺满整个培养瓶的表面,即可用0.25%胰酶和0.02%EDTA液将贴壁细胞消化分离,然后按1：3的比例进行传代培养,并记做P1,选取生长均一的P3细胞,进行诱导实验。1.2.2MSCs的体外诱导实验:将P3细胞用0.25%胰酶消化后,清洗2次后制成细胞悬液,以1×105个/ml密度接种于预先经过处理置有盖玻片的6孔板中,分成两组,每组选3个孔,实验组加10µmol/L5-aza,对照组不加任何诱导剂。作用24h后,去掉含5-aza的培养液,用DMEM溶液洗涤2次后改加基本培养液,以后每3d换液1次,21d后行免疫细胞化学染色。1.2.3光镜观察:将培养21d的每组盖玻片取出1张,用10%甲醛固定10min,PBS洗涤,进行HE染色,镜下观察细胞形态变化特征。1.2.4免疫组化染色:将每组培养21d的长有细胞的盖玻片取出,用-20℃甲醇固定10min,PBS液冲洗,按二抗试剂盒说明步骤进行染色。各组细胞免疫组化染色后光镜下随机取10个非重叠视野,计算阳性细胞百分比例,结果用x±s表示。2结果免疫组化鉴定为进一步确定MSCs是否分化成心肌细胞,采用心肌特异性肌钙蛋白I(cTnI)进行鉴定。结果显示,实验组胞质内出现棕黄色颗粒状复合物呈阳性表达(图4),而对照组呈弱阳性或阴性。3讨论参考文献