考马斯亮兰法（bradford法）蛋白质含量测定一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。二、试剂与器材2.1试剂：①标准蛋白质溶液：0.1mg/ml牛血清蛋白(bsa)：称取牛血清蛋白25mg，加入去离子水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用去离子水稀释至100mL即可。②考马斯亮兰g-250染料试剂：称取25mg考马斯亮兰g-250，溶于12.5ml95%乙醇后，再加入30mL85%磷酸，用去离子水稀释至250mL，贮存于棕色瓶中。常温下可保存一个月。2.2仪器及器材：紫外可见分光光度计、具塞试管、研钵、离心机、离心管（2mL）、移液器等。三、操作方法3.1标准曲线的绘制①取7支具塞试管，按照表1加入相应试剂，每加完一管，立即充分混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。表1考马斯亮兰法实验表管号1234567(0.1mg/ml)标准蛋白质(mL)00.10.20.40.60.81.0去离子水（mL）10.90.80.60.40.20考马斯亮蓝g－250试剂5.05.05.05.05.05.05.0光吸收值（A595）②放置5min，在595nm处测定吸光度，空白对照为第1号试管。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。③用标准蛋白质浓度（mg/ml）为横座标，吸光度值A595为纵座标，绘制标准曲线。3.2样品的测定称取鲜样0.2g，用2mL去离子水研磨成匀浆后，4000r/min低温离心10min，取上清液1.0mL（可根据蛋白质含量适当稀释）于试管中，然后加入5.0mL考马斯亮兰g-250，放置5min，在595nm处测定吸光度，以空白为对照。四、结果计算根据样品的吸光值A和制作的蛋白质标准曲线，求出样品中蛋白质的含量。C×VTVS×WF（mg/g）样品中蛋白质的含量=式中：C为根据样品的吸光值A和制作的蛋白质标准曲线求出的蛋白质的量（mg）；VT为提取液的总体积（mL）；WF为样品鲜重（g）；VS为测定时加样量（mL）。