抗体效价的测定2、基本原理免疫酶技术:酶标Ab/Ag,酶结合物得酶在免疫反应后,作用于厎物后显色,根据颜色得有无和深浅,定量测定Ab/Ag。免疫反应:一次或数次具Ag,Ab特异得免疫学反应酶促反应:只进行一次显示出生物放大作用,灵敏度ng,pg60年代初期,Averameas&Ram等建立了免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)利用特殊得交联剂研制出辣根过氧化物酶---人血清白蛋白及酸性磷酸酯酶---抗体,统称为酶标记物或酶结合物,用于抗原或抗体得示踪、定位或定量测定酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbentassay简称为Elisa)-----是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)得基础上发展起来得一种新型得免疫测定技术。本法兼有灵敏度高和特异性强两方面得优点。1974年Voller等用聚苯乙烯微量反应板作为免疫吸附剂吸附抗体(抗原),再与相应得酶标记物结合操作更方便,易重复灵敏度可高达ng(10-9g)至pg(10-12g),(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)免疫标记技术应用各种液相和固相免疫分析方法,对体液中得半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定酶------性能稳定、经济易得、底物无色、产物显色,便于检测常用得酶:碱性磷酸酯酶、辣根过氧化物酶(horseradperoxidase简称HRP)、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等。戊二醛法,过碘酸氧化法将酶与Ab交联在一起图一直接型Elisa大家学习辛苦了，还是要坚持图二间接型Elisa图三双抗体夹心型ELISA图四固相抗体竞争型ELISA未知抗原量=A(1)-A(2)每次反应后都要反复洗涤？保证反应得定量反应防止重叠反应,引起非特异现象。Partiallypurified,inactivatedHIVantigensantigenspre-coatedontoanELISAplate部分纯化,灭活病毒抗原抗原涂到酶标板Patientserumwhichcontainsantibodies、IfthepatientisHIV+,thenthisserumwillcontainantibodiestoHIV,andthoseantibodieswillbindtotheHIVantigensontheplate、病人血清中含有抗体。如果病人是艾滋病毒+,那么这个血清含有艾滋病毒抗体,这些抗体可以绑定到病毒抗原板Anti-humanimmunoglobulincoupledtoanenzyme、Thisisthesecondantibody,anditbindstohumanantibodies、抗人免疫球蛋白耦合酶。这是继抗体,并结合人类抗体substratewhichchangescolorwhencleavedbytheenzymeattachedtothesecondantibody、基板而改变颜色,当裂解酶附二抗体positiveProteinproteininteraction---ELISA2、petitiveelisasameepitopeCoatwithbaitprIncubatewithprimaryantibodyantibaitprandvariousconcentrationpreyprotein(竞争同一表位。外套与诱饵蛋白培养初级抗体抗诱饵蛋白及不同浓度得猎物蛋白)4、操作方法4、1包被特异性抗原:固体抗原(如蛋白质)用包被液稀释至10Oμg/ml,每凹孔加100μL,加盖置4℃过夜(37℃2h),次日倾去凹孔内液体,用滴管取洗涤液在每孔中加3～4滴,静置3min后倾去,重复3次,将反应板扣放在滤纸上,以除净液体。4、2封闭:每孔中加入200－400μL封闭液,加盖或用封口膜封板,置37℃恒温箱60min,倾去孔内液体,按上法洗涤3次。4、3加待测血清(内含抗体)、阴性血清(无抗体)及稀释液(PBS/Tween):待测血清按倍比法用稀释液稀释(1:100、1:200等),阴性血清也稀释成1:100,取不同稀释度得待测血清,阴性血清及稀释液(PBS/Tween)各1OOμL加至相应得凹孔中,加盖或封板,置37℃恒温箱1h,使抗体与固相抗原进行特异性结合,反复洗涤3次。123456784、4加酶标抗体:按说明书要求用稀释液稀释HRP-抗体(抗抗体),每孔加l00μL,封板后置37℃温育lh,按上法至少洗涤5次,最后用蒸馏水洗涤2次,扣在滤纸上吸干水分。4、5显色:每孔加入OPD应用液1OOuL、反应板置室温暗处5～30min。当显示橙色时应及时终止反应。4、6终止