分子杂交分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在，以及其分子量大小。根据其检测对象的不同可分为Southern杂交、Northern杂交和Western杂交，以及由此而简化的斑点杂交、狭线杂交和菌落杂交等。一、Southernblotting1．转膜当目标DNA经过限制性酶切并通过琼脂糖凝胶电泳以后，在0.4NNaOH碱性条件下变性，再在1.5MNaCl/1MTris（pH7.4）条件下中和使DNA仍保持单链状态。然后通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。图4-2是通过毛细管渗吸法进行Southernblotting的经典装置图。2．分子杂交2.1预杂交将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。2.2杂交在一定的溶液条件和温度下，将标记的核酸探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸附在滤膜上。2.3洗膜经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。3．检测3.1放射性标记、检测在分子克隆操作中用于标记核酸分子的标记物主要是放射性同位素，如32P，33P和35S。在掺入核苷酸的标记过程中，只有三磷酸核苷酸的α位磷酸整合到核酸链中，因此使用α位磷酸被标记的三磷酸核苷酸，如[α-32P]dATP。而在标记5'末端磷酸基团的反应中一般使用γ位磷酸被标记的ATP。放射性的信号通过X-光片放射自显影或磷屏扫描获取。3.2非放射性标记、检测。其中应用最成功的是原德国宝灵曼公司开发的地高辛（digoxygenin,DIG）标记核酸探针。将DIG与dUTP交联，在参入核苷酸的标记反应中用DIG-11-dUTP（或DIG-11-UTP）取代dTTP（或rTTP），使探针DNA或RNA分子被DIG标记。DIG标记的检测是该技术的核心，即利用抗DIG的抗体通过酶联免疫反应来完成。将抗DIG的抗体与碱性磷酸酶偶联，通过免疫反应将碱性磷酸酶携带到目标核酸分子处，在加入显色剂BCIP/NBT（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/盐酸氮蓝四唑）后碱性磷酸酶与显色剂反应形成浓紫色偏棕色沉淀，从而显示出目标分子的有无和位置。图4-3是通过地高辛标记探针的Southern杂交实例。M，地高辛（DIG）标记的分子量标准（lDNA/HindⅢ）；1-3，苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株的总DNA分别经KpnⅠ－PstⅠ、PstⅠ和KpnⅠ酶切。以cry1Aa杀虫晶体蛋白基因中的728bp片段作探针，通过随机引物标记的方式，用DIG标记探针。结果显示，该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷贝数明显不同。预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。图4-3：通过地高辛标记探针的Southern杂交结果通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。Southern杂交主要用来判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。应用该技术的前提是必须要有探针。4．探针的标记在一个核酸样品中查找是否存在某一特定序列的分子可用分子杂交来检测，但首先要有一段与目标核酸分子的序列同源的核酸片段。将该片段标记后与样品核酸进行分子杂交，通过检测标记核酸的存在从而判断样品中特定核酸片段的存在。用作检测的核酸片段即为探针（probe）。4.1均匀标记间接标记不是标记探针分子本身，而是复制一段新的探针分子，在复制过程中掺入标记的核苷酸（如[α-32P]dATP），从而使整个新分子被均匀地标记。4.1.1切口平移标记这种标记方式目前只有通过大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ来完成，只有该酶具有5'-3'外切活性。通过在待标记的DNA分子上产生切口，该酶引发5'-3'外切反应，在随后的5'-3'DNA聚合反应中若存在标记的脱氧三磷酸核苷酸（dNTP），新合成的核酸链就带有标记物。在整个标记反应体系中，待标记的DNA分子的任何一条链中的任何位点（除靠近5'端外）都可能作为标记反应的起始点，并持续到该链的3'末端。因此，新合成的被标记的分子可以代表该待标记的DNA分子的绝大部分核苷酸序列。4.1.2随机引物标记利用由6个核苷酸组成的序列随机的寡核苷酸为引物，在Klenow酶的作用下对目标DNA进行随机扩增。这样扩增出来的DNA产物包括从任意某个位点（可能最靠近5'的一些核苷酸除外）起始的单链DNA片段，其整体应该包含了目标DNA所有核苷酸序列信息。在扩增中加入标记的dNTP，扩增出来的DNA产物就可用作探针。该方法多用来标记一个DNA片段。4