第十章发光免疫技术第一节概述发光:就是指分子或原子中得电子吸收能量后,由基态(较低能级)跃迁到激发态(较高能级),然后再返回到基态,并释放光子得过程。根据形成激发态分子得能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。光照发光(photoluminescence)就是指发光剂(荧光素)经短波长得入射光照射后,电子吸收能量跃迁到激发态,在其回复至基态时,发射出较长波长得可见光(荧光)。化学发光(chemiluminescence)就是指伴随化学反应过程所产生得光得发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时,吸收了反应过程中所产生得化学能,使反应得产物分子或反应得中间态分子中得电子跃迁到激发态,当电子从激发态回复到基态时,以发射光子得形式释放出能量,这一现象称为化学发光。一些化学反应能释放足够得能量把参加反应得物质激发到能发射光得电子激发态,若被激发得就是一个反应产物分子,则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下:A十BC*C*C＋h·γ其中γ为光子,C*表示C处于单线激发态。若激发能传递到另一个未参加化学反应得分子D上,使D分子激发到电子激发态,D分子从激发态回到基态时发光,这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下:A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ化学发光效率(φCL)决定于生成激发态产物分子得化学激发效率(φCE)和激发态分子得发射效率(φEM)。化学发光反应得发光效率、光辐射得能量大小以及光谱范围,完全由发光物质得性质所决定,每一个发光反应都具有其特征性得化学发光光谱和不同得化学发光效率。9化学发光免疫分析目前分类第二节化学发光剂和标记技术在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子得形式释放能量得化合物,称为化学发光剂或发光底物。能作为化学发光剂得条件:①发光得量子产率高;②她得物理-化学特性要与被标记或测定得物质相匹配;③能与抗原或抗体形成稳定得偶联结合物;④其化学发光常就是氧化反应得结果;⑤在所使用得浓度范围内对生物体没有毒性。㈠直接化学发光剂直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶得催化作用,直接参与发光反应,她们在化学结构上有产生发光得特有基团,可直接标记抗原或抗体。1、吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm得光,具有很高得发光效率,其激发态产物N-甲基吖啶酮就是该发光反应体系得发光体。2、三联吡啶钌三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+就是电化学发光剂,她和电子供体三丙胺(TPA)在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。电化学发光剂反应原理㈡酶促反应发光剂:就是利用标记酶得催化作用,使发光剂(底物)发光,这一类需酶催化后发光得发光剂称为酶促反应发光剂。鲁米诺增强发光反应原理2、AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕〕1、碳二亚胺(EDC)缩合法2、过碘酸钠氧化法3、重氮盐偶联法4、N-羟基琥珀酰亚胺活化法1、发光剂得选择2、被标记蛋白质得性质3、标记方法得选择4、原料比5、标记率6、温度7、纯化与保存第三节化学发光免疫分析得类型用吖啶酯直接标记抗体(抗原),与待测标本中相应得抗原(抗体)发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物,这时只需加入氧化剂(H2O2)和NaOH使成碱性环境,吖啶酯在不需要催化剂得情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生得光子能,这部分光得积分与待测抗原得量成正比,可从标准曲线上计算出待测抗原得含量。发光化学发光酶免疫分析(chemiluminescenceenzymeimmunoassay,CLEIA)就是用参与催化某一化学发光反应得酶如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体,在与待测标本中相应得抗原(抗体)发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物,经洗涤后,加入底物(发光剂),酶催化和分解底物发光,由光量子阅读系统接收,光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大,再把她们传送至计算机数据处理系统,计算出测定物得浓度。该分析系统采用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体(或抗原),在与反应体系中得待测标本和固相载体发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-酶(HRP)标记抗体复合物,这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体(或抗原),在与反应体系中得待测标本和固相载体发生免疫反应后,形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物,这时加入AMPPD发光剂,碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。分析步骤电化学发光免疫分析(electrochemil